[发明专利]细胞色素P450_3A4酶的特异性探针底物及其应用

说明书

本发明提供了一类细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物Tenuifoliside A及其在CYP3A4酶活测定中的应用，其中酶活测定的具体操作流程如下：Tenuifoliside A作为高特异性探针底物，并借助CYP体外孵育体系开展特异性底物的CYP催化反应，通过定量检测单位时间内产物生成量或底物消除量来测定各生物样品及细胞中CYP3A4酶的活性。本发明可用于不同个体来源生物样本中CYP3A4酶活性的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP3A4单酶活性的定量测定。

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及寡糖酯类化合物Tenuifoliside A，其可作为细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物，用于不同来源生物样本中细胞色素P4503A4酶活性的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP3A4处置药物能力的评估。

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)超家族包含了机体内最重要的药物代谢酶，参与约80％以上上市药物的代谢，其中经细胞色素P4503A亚家族代谢的药物约占50％。人体中表达了四种细胞色素P4503A亚型，分别为细胞色素P4503A4、P4503A5、P4503A7以及P4503A43。细胞色素P4503A4占总细胞色素P450酶含量的30～60％(Hukkanen，et al.，1998)，在肝、肠、肾、脾、心脏各器官中有非常广泛的分布，相比于人群中表达量低、表达频率低的细胞色素P4503A5，一直被认为是成年个体表达的最主要的细胞色素P4503A单酶。一般来讲，CYP3A亚家族中的各种亚型的酶都具有相似的底物具体性，也就是说，某一底物若被CYP3A4催化代谢，那么这一底物就极可能同时被CYP3A5及其它CYP3A家族的酶代谢。目前，已经发现的或已在体外、体内研究中广泛应用的CYP3A亚家族探针底物，如咪达唑仑(midazolam)、尼非地平(nifedipine)、睾酮(testosterone)、雌二醇(estradiol)等，都同时是CYP3A4和CYP3A5的特异性底物。相对应的，利用这些探针底物对细胞色素P450酶进行的评估结果反映的就是细胞 色素P4503A亚家族各单酶的催化能力的总和。然而，近期的研究发现，细胞色素P4503A5在某些个体中显现的催化能力甚至与细胞色素P4503A4的催化能力相当(Williams，et.al.,2002)，此时利用目前已有的探针则会混淆细胞色素P4503A4和3A5的催化能力，从而无法清晰地分析细胞色素P4503A4对某药物的代谢清除能力。

此外，在鼠(细胞色素P4503A1、细胞色素P4503A2)、狗(细胞色素P4503A12、细胞色素P4503A26)，兔(细胞色素P4503A6)，猪(细胞色素P4503A29)，猴(细胞色素P4503A64)等哺乳动物体内，也高表达细胞色素P4503A4的同功酶，这些酶之间的底物有非常广泛的重叠性。利用细胞色素P4503A4的高特异性探针也可在体外活性测定方面实现对不同种属中细胞色素P4503A4的同功酶的评价与考察。

目前，细胞色素P4503A4酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分、新鲜提取的肝细胞、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology inVitro2006，135-153)，其中已经商品化的重组细胞色素P4503A4单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞胞浆及S9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(如：NADPH等)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的细胞色素P4503A4酶活性进行表征。余琛等人还利用肝微量穿刺法构建了新型微量肝组织体外孵育体系，并采用咪达唑仑作为探针底物，通过测定咪达唑仑与其代谢产物1-羟基咪达唑仑含量的比值，来作为细胞色素P4503A体外活性评价指标。

综上所述，评估细胞色素P4503A4代谢酶活性，关键在于选择高特异性的探针药物。

发明内容