[发明专利]一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法

权利要求书

1.一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒，其组成为：NADPH再生系统；0.1mol/L磷酸盐缓冲液；混合探针底物；混合探针底物的代谢产物；肝微粒体；所述六种混合探针底物为：非那西丁（5mmol/L），咪达唑仑（250μmol/L），甲苯磺丁脲（12mmol/L），右美沙芬（500μmol/L），安非他酮（2.5mmol/L），美芬妥英（5mmol/L）；所述六种混合探针底物的代谢产物：扑热息痛（1μg/ml），1-羟基咪达唑仑（1μg/ml），4-羟基甲苯磺丁脲（1μg/ml），右啡烷（1μg/ml），羟基安非他酮（1μg/ml），4-羟基美芬妥英（1μg/ml）。

2.按权利要求1的试剂盒，其特征在于：NADPH再生系统包括A液：2.5mmol/L NADPNa2，10U/mL6-磷酸葡萄糖脱氢酶，20mmol/L氯化镁，B液：50mmol/L6-磷酸葡萄糖。

3.按权利要求1的试剂盒，其特征在于：0.1mol/L磷酸缓冲液组成是29g磷酸氢二钠，2.96g磷酸二氢钠，42.5g氯化钠，11.8g氯化钾，最终溶解于1升蒸馏水中。

4.按权利要求1的试剂盒，其特征在于：肝微粒体可以是小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体中的一种，其浓度为20mg/ml。

5.一种CYP450酶抑制药物的研究方法，其特征在于包括如下步骤：

1）通过配制245μL孵育的NADPH再生反应体系包括50μLA液+10μLB液+2.5μL混合探针底物+2.5μL系列药物浓度+180μL0.1mol/L磷酸缓冲液预孵育于37℃水浴中5min，再加入20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体5μL，孵育1h；所述2.5μL混合探针底物在250μL孵育系统终浓度为非那西丁（50μmol/L），咪达唑仑（2.5μmol/L），甲苯磺丁脲（120μmol/L），右美沙芬（5μmol/L），安非他酮（25μmol/L），美芬妥英（50μmol/L）；

2）然后，按体积比为甲醇:乙腈=1:1的比例配置蛋白沉淀液，用3倍体积的蛋白沉淀液沉淀蛋白，涡旋震荡2分钟，14000转离心10分钟，取上清进样于LC-MS/MS，计算系列药物浓度对六种酶的抑制百分率，由GraphPad Prism 5软件绘制抑制曲线并计算IC₅₀值。

6.按权利要求5的研究方法，其特征在于：250μL NADPH再生反应体系中NADPNa2终浓度为0.5mmol/L，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，氯化镁的终浓度为4mmol/L，6-磷酸葡萄糖的终浓度为10mmol/L。

7.按权利要求5的研究方法，其特征在于：系列药物浓度在250μL孵育系统终浓度为0.05、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100μmol/L，再加一个Control组，药物溶解的有机相用乙腈溶解，最终整个孵育体系乙腈的比例控制在1%以下即可，甲醇或二甲基亚砜溶解有机相比例应控制在1‰以下。

8.按权利要求5的研究方法，其特征在于：小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体在250μL孵育系统中蛋白终浓度为0.4mg/ml。