[发明专利]猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因检测技术领域的方法及检测引物，具体是一种猪流行性腹泻病毒N基因Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法及其引物。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种对猪群具有强感染性的病毒，可引起猪群出现水样腹泻、呕吐、厌食消瘦的症状，尤其对初生仔猪的发病率和致死率可达90-100%。该病毒引起的猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea,PED）1971年首次在比利时爆发，之后在捷克、中国、韩国、越南及美国等国家均有爆发。自2010年10月以后，由新的流行株所引起的PED开始在我国和美国等地爆发，给我国和世界养猪业造成了重大经济损失。因此建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。

PEDV编码四种结构蛋白，分别为纤突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜内蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白，其中N蛋白是长度为441个氨基酸，可以广泛磷酸化，是病毒核糖核蛋白的组成部分，含有3个相对保守的结构域，有6-7个潜在的磷酸化位点。N蛋白的主要功能是在病毒RNA合成过程中发挥重要作用，可以参与病毒基因组的转录，它能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装。由于N蛋白高度保守，且随着病毒复制过程表达量较高，在猪感染PEDV的早期，即可以检测到针对N蛋白的抗体。因此N蛋白所有这些特征使得病毒得到准确和尽早诊断提供了可能，可以利用N蛋白来建立针对PEDV分子生物学诊断技术。目前已经建立了许多PEDV的荧光定量PCR检测法，但均与本方法有所不同。

中国专利文献号CN103667531A公开(公告)日2014.03.26，公开了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)的ORF3保守基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物，建立一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的SYBRGreenI实时荧光PCR方法。该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍，并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，该方法可用于猪场PEDV快速检测。但该技术假阳性率较高，敏感性较低，精确性较差。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物，根据猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计引物，通过对荧光定量(RT-PCR)反应条件的优化，具有较好的特异性和重复性，比普通PCR检测方法敏感794倍的同时可以广泛用于PEDV的快速检测。

本发明可以相对定量地检测目的基因，该方法适用于病毒样品的临床检测，能为我国PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。由于探针法荧光定量PCR方法的假阳性率低于SYBRGreen染料法，检测结果更加准确。可以通过样品检测结果与标准曲线对比，确定样品中试剂的目的基因拷贝数，同时也可以作为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。

该方法能够同时适用与对PEDV流行株与经典毒株的检测。该引物的扩增产物为169bp的引物对，并以此设计荧光探针寡核苷酸序列。根据设计的引物及探针，建立并优化荧光定量PCR方法，并通过构建阳性质粒，设置标准品为10⁹-10³拷贝数加至反应体系中，扩增得到标准曲线，标准曲线的线性良好，并且所得的相关系数为0.999。通过进一步验证，发现该方法特异性、敏感性及重复性结果较好。说明该方法在临床应用上能够有更高的准确性。同时，与传统的TCID₅₀法测定病毒增殖曲线相比，本方法所测定的PEDV增殖曲线符合病毒增殖规律，可以作为一种快速的测定增殖曲线的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物，包括如Seq ID No.1所示的上游引物序列PEDV-P1、如Seq ID No.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq ID No.3所示的探针PEDV-MGB。

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法，PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，用于测算出待测样品中的病毒含量。

所述的PCR扩增、克隆是指：采用上述上、下游引物进行PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆。