[发明专利]一种基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及兽医生物制品领域的诊断试剂，具体提供了一种具有广谱中和活性的单抗隆抗体和以此为抗体建立的NDV胶体金免疫层析技术及试纸条。 

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的高度接触性、传染性疫病，可导致禽类的大量死亡或生产性能的急剧下降，给世界养禽业造成巨大的经济损失。国内外学者对新城疫的诊断方法进行了大量研究，传统的诊断方法包括病毒分离，ELISA、琼脂扩散实验、中和试验、血凝和血凝抑制试验等。近年来RT-PCR、荧光定量PCR、核酸诊断技术、限制性内切酶分析等分子生物学技术也广泛应用到ND的诊断上，但上述方法繁琐费时，需要一定的实验条件和实验人员及特殊的仪器设备，不方便在基层养殖场推广使用。 

对于本领域而言，能够快速、准确诊断该病，对疫情监测，控制流行，减少养殖成本具有重要意义。而利用具有广谱中和作用的单克隆抗体来满足上述要求，在现有技术的基础上已经成为了可能，如何利用这一技术则成为现有技术亟待解决的问题。 

发明内容

本发明针对现有新城疫病毒非诊断检测方法中存在的问题，利用新制备的抗新城疫血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，获得了对NDV具有广谱中和作用的单克隆抗体，并利用该抗体研制了快速检测新城疫病毒的免疫胶体金检测试纸条。采用本发明的试纸只需一步加样，5m in就能判定结果，具有简单快速、特异敏感的特点，本试纸条的研制为新城疫的快速诊断提供了一种更加实用的工具和方法，适合基层兽医站和中小养殖场使用。 

本发明的具体技术方案是： 

发明人首先提供了一株全新的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株C3B3，同时进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：C2013174。 

利用该杂交瘤细胞株，发明人进一步获得了对NDV具有广谱中和作用的单克隆抗体，具体步骤如下： 

1.单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备 

病毒的纯化：将NDV LaSota标准病毒接种9-10日龄鸡胚，收获死亡鸡胚的尿囊液，将尿囊液冻融1次，15000rpm/min离心1h，收取上清再经30000rpm/min高速离心机离心2.5h，去上清，沉淀以PBS(pH7.4)悬浮，以蔗糖密度梯度离心35000rpm/min离心2min，收获纯化的NDV LaSota病毒； 

以纯化的NDV LaSota病毒为免疫原，免疫6周龄～8周龄Balb/c小鼠6只，每次每只的免疫剂量为50ug，免疫方法为腹腔注射，一共免疫四次；每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化蛋白；三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,监测血清抗体效价；四免两周后,选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合，置于37℃5%CO₂培养箱培养； 

5d～7d后用HT换出1/2HAT培养基，7d～10d后用HT换出全部HAT；采用间接ELISA和血凝抑制试验(HI实验)筛选均为阳性的克隆作为备选杂交瘤细胞株； 

其中所述的ELISA法筛选具体是：将纯化后的病毒按10ug/mL包被ELISA板，将杂交瘤细胞分泌的单抗（即细胞培养物上清）与之结合，检测孔的OD值与阴性对照的OD值的比值大于等于2为阳性； 

所述的血凝抑制实验的具体步骤为：吸取25μL ELISA检测阳性孔的营养液加入96孔V型板第一个孔中，然后以25μLPBS(pH7.4)进行倍比稀释至第11孔，第12孔为PBS对照孔，加入4HA单位的LaSota原始标准病毒25μL，室温作用20min后加入1%鸡红细胞25μL， 15-20min后判定结果，以不凝集鸡红细胞的最高稀释倍数为血凝抑制价； 

通过上述方法挑取ELISA阳性和有血凝抑制性的阳性克隆以有限稀释法亚克隆3次，最后挑选ELISA检测中OD值反应值较高的单克隆扩大培养并作为建株细胞，并对其进行生物保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2013174； 

2、单抗腹水的制备 

8周龄～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡油0.5mL/只，7d后腹腔注射处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞50万/只；每天观察至小鼠腹部明显膨大，抽取腹水并离心后取上清，从而获得阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗； 

通过离心可以去除掉腹水中的脂肪和血细胞，进而可以从腹水中获得足量的单克隆抗体用于后续的鉴定和制备。 

3、单抗特性鉴定