[发明专利]一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子及其在生产牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB上的应用。

背景技术

抗菌肽是在诱导条件下, 生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α-螺旋型、β-折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸的等多种类型。抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有很强的杀灭作用，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品工业等方面。在医药卫生方面，抗菌肽与抗生素最大的不同之处在于抗菌肽的应用可以解决抗药性的问题。具有与抗生素完全不同杀菌机理的抗菌肽的应用或许可以为这些问题的解决提供途径。在食品工业上抗菌肽的应用主要是食品添加剂。抗菌肽的杀菌能力很强，并且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有广泛的杀菌作用，因此可以代替传统的食品防腐剂，起到保鲜作用。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害。此外，抗菌肽在、畜牧业、农业等各个方都有十分广泛的应用。研究其大规模生产具有十分积极的意义。

 酿酒酵母在食品业使用有数千年的历史，也是生物学研究的模式生物之一。随着DNA重组技术的发展, 酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主，其是真核生物，无内毒素，长久以来在食品和酿酒工业中广泛应用；胞外分泌表达蛋白，简化了表达产物的分离纯化。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主。酿酒酵母中参与半乳糖代谢的有关GAL基因的转录是被紧密调控的，它们在没有半乳糖的培养条件下不被表达；而在半乳糖存在条件下，其表达水平可提高约1000倍。GAL1可调控启动子是目前广泛使用的酵母菌可控性启动子表达系统之一。使用的最广泛的酵母启动子是GAL基因体系中的GAL1、GAL10和GAL7，这些启动子的表达受到半乳糖的高度诱导，但却严格被葡萄糖所阻遏。葡萄糖是一种直接可以被利用的单糖，也是一种代谢中间产物，可以直接进入糖酵解途径产生能量为生物体所利用；对很多生物来说葡萄糖也是一种优先被利用的碳源，而半乳糖并不能在高浓度葡萄糖存在时作为碳源同时被利用，因为代谢半乳糖有关酶的基因的表达受到葡萄糖的抑制，也就是所谓的“葡萄糖的抑制”现象。GAL1启动子的上游阻遏序列（URS）也是通过阻遏蛋白Mig1调节Gal4p的抑制作用。葡萄糖会引起由非磷酸化形式的Mig1介导的GAL基因的几乎完全转录抑制，关闭GAL1启动子的表达，从而有效地终止半乳糖的利用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种解除葡萄糖抑制效应的pYES2质粒。

本发明的另一个目的在于提供上述质粒在生产牛乳铁蛋白肽LfcinB上的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种解除GAL1启动子葡萄糖抑制效应的方法，其是通过去除GAL1启动子的上游阻遏序列URS1而实现的。

所述GAL1启动子上游阻遏序列URS1的核苷酸序列为：TTAGCCTTATTT CTGGGGTAAT TAATC。

由上述方法制备得到的一种解除葡萄糖抑制效应的GAL1启动子。

一种解除葡萄糖抑制效应的pYES2质粒，其是通过去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

一种在酵母细胞中表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的重组质粒M-pYES2-α-LfcinB，其是通过在pYES2质粒中接入牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB基因序列和α信号肽基因序列、去除pYES2质粒中的GAL1启动子的上游阻遏序列URS1所得。

所述重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

含有上述重组质粒M-pYES2-α-LfcinB的酿酒酵母宿主菌。

一种生产牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB的方法，包括如下步骤：

（1）将重组质粒M-pYES2-α-LfB转化酵母感受态细胞；

（2）诱导表达牛乳铁蛋白抗菌肽LfcinB。

步骤（2）的具体操作为：挑选单克隆接种于YPD完全培养基， 28～32℃，50～250 r/min震荡培养45～55h，离心，收集酵母菌，分别用含4%半乳糖的SC培养基和和SC- U诱导培养基悬浮，使菌液终浓度达到OD₆₀₀=0. 3～0.5，置于18～22℃， 150～250 r/min的摇床诱导3～5h。