[发明专利]一种特异识别异质性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的寡核苷酸适配体C6‑8的序列和应用

说明书

发明领域：

本发明涉及特异识别hnRNPA2/B1蛋白的寡核苷酸适配体C6-8的序列和修饰，以及修饰后的C6-8在识别表达hnRNPA2/B1蛋白的多种肿瘤细胞方面的应用。本发明涉及C6-8在生物医药方面的应用，C6-8作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于临床肿瘤组织切片标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗。

背景技术：

目前，应用特异性抗体检测相关标志物的的免疫组织化学或免疫荧光方法还是临床病理诊断的“金标准”。就上皮源性的肿瘤而言，已有多种标志物抗体在临床应用。如角蛋白(Keratin，Ker)、细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)、上皮细胞膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等都是重要的肿瘤相关抗原，广泛存在于各种上皮性肿瘤，多种类型的糖蛋白类肿瘤相关抗原(carbohydrate antigen，CA)也相继被发现在上皮性肿瘤组织中表达增加，如80％以上的人体腺癌可在其细胞膜上检出CA72-4，而非上皮性的恶性肿瘤及良性增殖性病变均无该抗原表达。但总的看来，这些肿瘤相关抗原的特异性和敏感性都不高，临床上常常通过联合检测多种相关抗原来实现对肿瘤患者的临床辅助诊断、预后评价、疗效指导、复发与转移监测等。因此，更多的肿瘤标志物及其抗体亟待发现和制备应用。

高通量的生物技术方法为肿瘤标志物的鉴定及其探针的获得提供了便利途径。通常应用蛋白质组学的方法来鉴定新的肿瘤标志物，也有学者应用肿瘤细胞膜成分免疫动物直接获得识别肿瘤细胞的特异性抗体，进而利用抗体鉴定相应靶抗原，即肿瘤标志物。指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的寡核苷酸适配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组复合靶子中差异存在分子的aptamer，并能利用该适配体反过来对差异靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物，尤其是肿瘤标志物分子开辟了新的途径。

本发明是通过以完整细胞为靶子的SELEX技术获得了一个aptamer C6-8。经鉴定，C6-8 能够特异识别多种肿瘤细胞株，包括乳腺癌细胞株MCF7、肝癌HepG2细胞，肺癌细胞株H1299，喉癌Hep2，卵巢癌CAOV-3，子宫颈癌HeLa；C6-8还能够特异识别受试的临床肝癌患者的癌组织切片中的异型癌细胞。对照核酸序列与上述细胞及组织均无结合。

利用链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的C6-8适配体pμll-down钓取结合的靶蛋白，经生物质谱和EMSA鉴定，证实C6-8所结合的靶蛋白为异质性核糖核蛋白A2／B1(hnRNPA2／B1)。有文献报道，在多种肿瘤组织包括乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌和结肠癌组织中，可以观察到hnRNPA2／B1蛋白的表达水平升高，而且主要定位于细胞核，因此我们推测hnRNPA2／B1蛋白有可能作为多种肿瘤的特异生物标志物。hnRNPA2／B1蛋白作为一种重要的RNA连接蛋白，是细胞核中异质性细胞核核糖蛋白核心复合体的主要成分。hnRNPA2／B1蛋白可参与mRNA的剪接、核-胞质的转运、转录后调控、染色体稳定性调控等。最近研究表明，hnRNPA2／B1可能在肿瘤发生发展过程中起重要作用。

由于C6-8经FITC标记修饰后可直接用于荧光方法检测肿瘤细胞，操作较传统免疫学方法更简单。该发明可以在临床医学及基础医学中得到广泛应用。

发明内容：

本发明目的在于提出特异识别hnRNPA2／B1蛋白的寡核苷酸适配体C6-8的序列及其应用领域，包括在临床肿瘤组织切片标本的辅助鉴别、基础研究以及肿瘤生物导向治疗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：