[发明专利]大豆食心虫人工饲料及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及大豆食心虫人工饲料及其制备方法和应用，具体涉及制备大豆食心虫人工饲料的方法、大豆食心虫人工饲料、人工饲养大豆食心虫的方法、用于筛选大豆食心虫靶基因的方法、杀虫剂及植物培养方法。

背景技术

大豆食心虫目前是东北大豆产区发生最严重的害虫之一，以幼虫钻蛀豆荚取食豆粒，将豆粒咬成沟道或残破状，不仅使大豆田严重减产，而且降低大豆品质。化学杀虫剂是防治食心虫的常用方法。但大量和长期使用不仅使大豆食心虫抗药性逐年增加，而且污染环境。转Bt抗虫基因一度为害虫防治带来希望，并在抗虫棉的应用上取得了良好的田间防治效果和巨大的经济效应。然而，随着转Bt基因棉花的大面积种植，棉铃虫对Bt蛋白的抗性已成为不容忽视的问题。利用传统育种方法培育抗食心虫大豆品种，对防治食心虫虽然有效，但是周期长、效率低。因此，发展有效控制大豆食心虫的新方法，是当前该领域的重要研究课题。

RNA干扰（RNA interference）是一种由外源或内源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发同源mRNA特异性降解的现象，是近年来发现的一种新的基因调控机制。一般认为，双链RNA在细胞内经Dicer酶切割成21-25nt（碱基）的siRNA（short interferencing RNA）。siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA进一步与体内Argonaute蛋白家族成员结合形成RISC（RNA-induced silencing complex)，最后RISC介导siRNA反义链与靶mRNA互补结合，切割同源靶mRNA分子，引起同源靶mRNA分子特异性降解。

由于RNAi技术沉默基因的高效性和特异性，人们利用转基因手段，让植物表达昆虫重要基因的dsRNA，dsRNA藉由植食性昆虫取食进入到昆虫体内，对靶基因进行RNA干扰，从而抑制昆虫靶基因的表达，提高了植物的抗虫性，为培育新一代抗虫作物带来契机。

目前，利用RNA干扰技术培育抗虫转基因作物，主要通过转基因手段，使作物表达昆虫重要基因的dsRNA，籍由昆虫取食进入消化道，只有dsRNA被昆虫吸收，dsRNA才能介导内源靶基因沉默，抑制靶基因表达，使昆虫滞育或死亡。因此，获得目标害虫的靶基因，是开展RNA技术防治虫害研究的基础。目前面临的一个主要挑战就是寻找一个向目标昆虫体内导入dsRNA简单而且稳定的方法。显微注射法是RNAi研究中最广泛使用的dsRNA导入方法，该方法在蟋蟀G.bimaculatus、拟谷盗Tribolium castaneum、家蚕Bombyx mori、甜菜液蛾S.exigua、褐飞虱Nilaparvata lugens等昆虫中均取得成功。但显微注射法筛选昆虫靶基因最大的障碍就是显微注射法将昆虫dsRNA导入昆虫体内时产生机械损伤，很难确定昆虫的死亡是由靶基因干扰引起还是显微注射机械损伤造成，另外干扰效果还受注射体积和注射位置的影响。而将dsRNA加入到昆虫人工饲料的喂食方法对昆虫不会造成机械损伤，利用喂食dsRNA方法已经成功地干涉了浅棕苹果蛾Epiphyas postvittana,小菜蛾Plutella xylostella，棉铃虫Helicoverpa armigera等鳞翅目昆虫靶基因表达。因此，喂食方法是一种潜在的高通量筛选昆虫靶基因的方法。

然而，现阶段利用喂食法筛选大豆食心虫RNA干扰靶基因的人工饲料及具体方法仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人发现，制约利用喂食法筛选大豆食心虫的RNA靶基因方法的主要因素：一是没有能够持续大量饲养且能够让昆虫正常生长发育的人工饲料。这是因为，筛选大豆食心虫靶基因，首先都必须繁殖大量食心虫。大豆食心虫是东北大豆产区的主要害虫，它单食大豆，以初孵幼虫蛀入荚内为害，大豆食心虫一年只发生一代，从9月份脱荚入土滞育越冬，直到次年的7月中旬才化蛹羽化成成虫。在土中栖息达10个月之久。大豆食心虫幼虫主要取食豆荚皮内膜和嫩豆粒，大量采集天然饲料受季节的限制，而且天然饲料在离体情况下易变质，饲养难度很大，无法大批量繁殖。目前，有研究者采用黄豆芽饲养初孵幼虫，然后对一龄以后的幼虫利用人工饲料进行饲养，但尚无法实现人工饲料持续大量饲养。二是人工饲料里面的RNA酶，会降解加入到人工饲料里面的昆虫dsRNA，进而降低了通过取食人工饲料进如昆虫体内的dsRNA量，影响基因干扰对昆虫生产发育的影响的研究结果，从而影响靶基因筛选的准确性，以及后续利用RNA干扰技术培育抗虫转基因作物。