[发明专利]一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法

权利要求书

1.一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）αHL单体蛋白的表达

（2）αHL单体蛋白的纯化

（3）αHL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔

用十六烷配制DPhPC，用细针在DPhPC液体中释放αHL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE电泳；

（4）SDS-PAGE切胶法纯化αHL蛋白质纳米孔。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将αHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21(DE3)pLys，IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管（Millpore），5000r/min离心10min，取下层液体加入截留分子量为30kD（Millpore）的超滤管，5000r/min离心10min，取上层液体，即为αHL单体蛋白溶液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶的1/5切下，放入考马斯亮蓝G250染色液中染色，另外4/5胶存于4℃；将染好的凝胶放入脱色液中脱色，直至蛋白条带清晰可见；将此胶与未染色的凝胶对比，切下αHL蛋白质纳米孔所在区域，加入超纯水，-80℃反复冻融，低温离心收集上清液体，真空冷冻干燥，残留物用超纯水溶解，用SDS-PAGE凝胶分析并进行蛋白定量。

6.一种检测权利要求1所述方法制备得到的α-溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将预先打好小孔的Teflon膜装在电解槽中央，隔电解槽为两个小槽，用毛细管在孔周围滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在两槽中各添加1400μL的10mM Tris-HCl（含1M KCl），并用毛细管滴加磷脂，使液面缓慢没过小孔，用Ag/AgCl电极检测跨膜电势，使膜电流值在120pA，将αHL蛋白质纳米孔加入，采集和分析αHL蛋白质纳米孔单孔电流信号。