[发明专利]脑炎病毒基因修饰系统的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种脑炎病毒（Encephalitis Virus，EV）基因修饰系统的建立及其突变株应用，特别涉及一种在野生型脑炎病毒XJ-90260株基础上进行突变后得到的脑炎病毒突变株。

背景技术

脑炎病毒XJ-90260株属于披膜病毒科甲病毒属成员。病毒颗粒一般呈球形，直径60-70nm，具囊膜和微细纤突，核酸为单股正链RNA。该病毒可通过蚊虫叮咬，导致动物和人间疫情的暴发，既是典型的虫媒传染病病毒，也是传统的人兽共患病病毒。感染者大多呈流感样症状，但也有出现严重神经症状的患者，特别是在儿童，该病有较高的死亡率，给家庭和社会均造成沉重的负担。

目前，尚未有利用痘苗病毒载体基因修饰技术开展脑炎病毒相关研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种脑炎病毒突变株及其应用。

本发明所提供的脑炎病毒突变株，是将野生型脑炎病毒基因组RNA中编码E1蛋白的第253位氨基酸Phe的密码子替换为编码氨基酸Ser的密码子，且将编码PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重组病毒。

在本发明中，所述编码氨基酸Ser的密码子具体为AGC。

在本发明中，所述野生型脑炎病毒具体为脑炎病毒XJ90260株。

所述脑炎病毒XJ90260株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列3第45-11489位。

在本发明中，所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列具体为序列表中序列2的第45-11477位，即为将所述脑炎病毒XJ90260株的基因组cDNA序列（序列3的第45-11489位）的第10757-10759位的TTT（对应序列3的第10801-10803位）突变为AGC（对应序列2的第10789-10791位），且将第8552-8563位（对应序列3的第8596-8607位）缺失后得到的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述脑炎病毒突变株的方法。

本发明所提供的制备所述脑炎病毒突变株的方法，具体可包括如下步骤：

（a）将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段；

（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；

（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述脑炎病毒突变株。

在上述方法中，所述野生型痘苗病毒具体可为野生型痘苗病毒WR株。

进一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1的序列。

在上述方法的步骤（a）中，所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22）的第80267-80725位和第80726-81194位（对应序列1的第1-459位和第460-928位）的序列。

在上述方法中，在所述核苷酸片段A中，在所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列前，含有T7启动子相关序列；所述T7启动子相关序列具体可为序列表中序列2（或序列3）的第10-44位。