[发明专利]一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体是一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。 

背景技术

山羊绒是绒山羊的主要产品，是一种珍贵的纺织原料，具有极高的经济价值。绒毛是绒山羊皮肤的衍生物，初级毛囊生长粗毛，次级毛囊生长绒毛。绒山羊次级毛囊是一个精确的可再生器官，其周期性变化不仅控制着绒毛的生长发育，而且与产绒量、绒毛品质都紧密相关。次级毛囊的周期性变化过程是一个分子调控的过程，通过一系列信号通路和基因的相互作用来实现。在绒山羊次级毛囊周期性生长发育的分子调控机理方面，重点围绕绒山羊次级毛囊生长发育相关基因的筛选与鉴定、基因的克隆与表达模式分析以及寻找相关的调控因子，而开展这些研究工作的一个重要基础就是提取高质量的总RNA样品。 

绒山羊初级毛囊直径约为34-57微米，次级毛囊直径约为12-18微米。由于次级毛囊十分微小，分离过程较为困难，导致其总RNA提取不易。目前，在实验材料的选择上，绝大多数研究都是将绒山羊皮肤组织作为整体研究对象，提取其总RNA，没有直接分离次级毛囊提取总RNA。这样往往使得研究的目标人为扩大、工作量大幅度增加，给研究工作增添了许多不确定因素。此外，虽然也有从绒山羊离体皮肤组织块中分离次级毛囊并提取RNA的报道，但这些离体较长时间的次级毛囊肯定会引起RNA降解，导致实验结果的可靠性大大降低。 

一般的组织总RNA提取采用液氮研磨与TRIzol试剂相结合的方式均可实现。然而，由于绒山羊次级毛囊组织微小，使用液氮冷冻后漂浮在液氮表面而研磨困难，并且次级毛囊组织RNA含量相对较低，采用这种方法提取的RNA产量和质量无法得到保证。特别是在野外条件下，携带液氮罐保存、运输毛囊组织样本也会受到一定的限制，给采样工作带来很大麻烦。 

因此，有必要发展一种能够直接从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的有效方法，以满足基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的需要。本发明正是为了解决上述采样、保存、运输、提取等一系列难题而提供了一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。 

发明内容

发明目的：针对上述现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。 

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤： 

1）采集、保存和运输毛囊组织：采集羊毛和羊绒混合物，经RNAlater保存液处理并低温保存以样品满足长途运输的需要； 

2）分离次级毛囊组织：在RNAlater保存液中从羊毛和羊绒混合物中分离出羊绒，在距离羊绒根部毛囊泡1cm处剪断，收集所有带有完整毛囊泡的羊绒根部，即分离得到次级毛囊组织； 

3）提取次级毛囊组织总RNA； 

4）检测总RNA样品质量。 

上述步骤3）具体包括以下步骤： 

1）将分离的次级毛囊组织迅速转移到裂解液中，用研磨杵研磨裂解液中的次级毛囊组织，充分研磨以破碎组织得到混合液，研磨时间为5-10min，小心用尖头镊子剔除绒干；因毛囊是依附在绒干上的，研磨后组织脱落，需要剔除绒干。 

2）用移液器将研磨过的混合液转移到指形管中，10000rpm离心3-5min，小心将上清液转移到指形管中； 

3）向上清液中加入等体积的70%乙醇溶液并混匀，混匀后的溶液转移到硅胶膜吸附柱中，放入指形管后盖上管盖，10000rpm离心2-3min，弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中； 

4）向步骤3）处理后得到的吸附柱中加入500μL去除蛋白质溶液，10000rpm离心2-3min，弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中； 

5）向步骤4）处理后得到的吸附柱中加入1U/μL DNase I100μl，室温静置15-20min； 

6）向步骤5）处理后得到的吸附柱中加入500μL漂洗液，室温静置3-5min后10000rpm离心2-3min，弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中；重复漂洗操作两次； 

7）将步骤6）处理后得到的吸附柱在室温条件下静置5-10min，充分挥发掉吸附柱中硅胶膜上的漂洗液；