[发明专利]一种高产L‑丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种构建重组菌A的方法，包括如下步骤：将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到的重组菌A；

所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D；所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；

所述出发菌为大肠杆菌XZ-A26CGMCC No.4036。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白编码基因具体为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅱ同源重组到所述出发菌中；

所述DNA片段Ⅱ的核苷酸序列为序列表中序列2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述出发菌为通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。

5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌A。

6.一种构建重组菌B的方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的方法中所述的出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，且将所述出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；

所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D；

所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S；

所述clpA*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第1-2272位核苷酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：先所述出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到重组菌A，再将所述重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；

所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因；

所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因；

所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

所述将出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅲ同源重组到所述出发菌中；

所述将重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段Ⅳ同源重组到所述重组菌A中；

所述DNA片段Ⅲ的核苷酸序列具体为序列表中序列3；

所述DNA片段Ⅳ的核苷酸序列具体为序列表中序列4。

9.由权利要求6-8中任一所述的方法制备的重组菌B。

10.权利要求5所述的重组菌A或权利要求9所述的重组菌B在产生和/或提高L-丙氨酸中的应用；

所述产生和/或提高L-丙氨酸具体为将所述重组菌A或所述重组菌B在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵生成。

11.一种产生L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵权利要求5所述的重组菌A或权利要求9所述的重组菌B，收集发酵产物，即得到L-丙氨酸。