[发明专利]硫磺矿硫化叶菌中（+）γ-内酰胺酶的编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，涉及来源于硫磺矿硫化叶菌中第二种新的（+）γ-内酰胺酶的编码基因，及该（+）γ-内酰胺酶在拆分消旋体γ-内酰胺中的应用。 

背景技术

20世纪90年代国际上兴起了一项为人类造福的高新技术产业——手性药物，这是医药界的一次重大变革。（-）2-氮杂双环-[2,2,1]-庚烷-5-烯-3-酮（简称（-）γ-内酰胺）是合成抗艾滋病药物阿巴卡韦和抗流感药物帕拉米韦重要手性中间体。近几年，科学家利用酶的专一性，用微生物酶法高效性拆分消旋体γ-内酰胺，从而得到（-）γ-内酰胺。具有对环境友好，节约成本等优点。 

目前报道的能拆分消旋体γ-内酰胺的微生物有硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus P2）、氧化烃微杆菌（Microbacterium hydrocarbonoxydans）、嗜酸丛毛菌（Comomonas acidovorans）、洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、青枯假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）、嗜热泉生古细菌（Aeropyrum pernix）。由于野生菌生长缓慢，蛋白表达量低、不稳定等诸多缺陷，构建相应的基因工程菌并用于工业化生产备受青睐。但是只有硫磺矿硫化叶菌、嗜酸丛毛菌、大豆慢生根瘤菌及嗜热泉生古细菌找到了相应的编码基因并完成基因工程菌构建，纯化出了相应的（+）γ-内酰胺酶。 

本发明的创新之处在于从硫磺矿硫化叶菌中找到一种（+）γ内酰胺酶，此种（+）γ-内酰胺酶的编码氨基酸与硫磺矿硫化叶菌中已发现的（+）γ-内酰胺酶完全不同。这是首次从同一种菌中发现不同类型却具有相同功能的（+）γ-内酰胺酶。 

本发明的目的是提供一种新的、高效的能拆分消旋体γ-内酰胺的（+）γ-内酰胺酶。 

本发明所提供的（+）γ-内酰胺酶，来源于硫磺矿硫化叶菌，是如下（a）的蛋白： 

（a）由序列表中序列SEQ ID No:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质； 

其中，序列表中的SEQ ID No:1是由318个氨基酸构成。 

上述（+）γ-内酰胺酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它是具有以下核苷酸序列之一： 

（a）序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 

（b）编码序列表中SEQ ID NO:1蛋白氨基酸序列对应的多核苷酸。 

其中，序列表中的SEQ ID NO:2由957个碱基组成，其编码序列为自5，端的ATG起始密码子到3，端的TAA终止密码子的完整开放阅读框。 

一种重组载体，其特征在于：其上述的编码基因包括的核苷酸序列，原核表达载体为pET30或者pET28。 

一种表达宿主，其特征在于：含有上述的重组载体，一般表达宿主为大肠杆菌。 

所述的硫磺矿硫化叶菌中（+）γ-内酰胺酶的应用，为在拆分消旋体γ-内酰胺从而得到（-）γ-内酰胺的应用。 

所述应用为：将消旋体γ-内酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸缓冲液中，使消旋体γ-内酰胺底物浓度在0.005M-0.1M之间；然后向其中加入（+）γ-内酰胺酶，在90℃转化5-24h，制得（-）γ-内酰胺。 

进一步，纯化（+）γ-内酰胺酶蛋白采用热处理去除杂蛋白从而得到纯的（+）γ-内酰胺酶的。 

进一步，纯化的（+）γ-内酰胺酶在拆分γ-内酰胺的时加入Ni²⁺或Zn²⁺。