[发明专利]一种荧光素类H2S荧光探针及其制备、应用

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种荧光素类H₂S荧光探针及其制备和应用，该探针是以荧光素为发色团设计的荧光素类衍生物荧光探针，通过与H₂S反应生成荧光素，实现荧光“开-关”过程，以此来检测细胞内的H₂S。 

背景技术

众所周知，H₂S是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体。然而，近几年的研究表明，H₂S是继NO、CO之后又一重要的气体信号分子。它在调节心血管、神经、免疫、内分泌及肠胃系统方面有着重要的作用。¹H₂S是哺乳动物系统产生的一种内源性气体，主要由两种磷酸吡哆醛类酶，胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)催化L-半胱氨酸反应生成。²作为信号分子，H₂S可以调节神经传递、²松弛平滑肌、³调节胰岛素的释放、⁴调节炎症以及抑制细胞凋亡等。⁵内源性的H₂S水平被认为与许多疾病相关，如阿尔茨海默病、⁶唐氏综合症、⁷糖尿病⁸和肝硬化。⁹在动物疾病模型中，H₂S抑制剂、H₂S供体显示了H₂S的治疗开发潜力。¹⁰因此，将生物体系内H₂S的浓度、分布可视化显得尤为重要且有益于阐明H₂S的生物学作用。 

相比于已经报道的检测方法，如比色法⁸、电化学分析法⁹及气相色谱分析法¹⁰等，小分子荧光探针具有高灵敏度、实时成像、高时空分辨率等优 势。目前，已经报道的H₂S荧光探针多是利用H₂S的还原性或亲核性等反应特性来设计的。^11-16由于特异性反应的识别机制，即使在存在干扰的情况下，大多数H₂S荧光探针仍具有很高的选择性。然而，考虑到在生物组织中的应用，H₂S荧光探针在设计中仍然需要考虑到其他一些因素，如生物相容性、高吸收系数、荧光量子产率、可见光激发、高稳定性和高信噪比等。 

荧光素及其衍生物是生物学家和化学家广泛使用的一类有机荧光染料。由于它们良好的生物相容性、高吸光度、高荧光量子产率、良好的光稳定性等，荧光素及其衍生物经常被用于设计荧光探针、细胞标签及免疫探针等。例如，已报道的靶向FR-α的叶酸偶联异硫氰酸荧光素是第一个利用肿瘤特异性荧光成像技术对疑似卵巢癌病人肿瘤组织进行实时外科手术可视化的范例。¹⁷螺内酯型荧光素衍生物是一类无色无荧光物质，当相应的内酯开环后，就产生了强烈的绿色荧光。¹⁸近年来，由于螺环开环机理具有高信噪比的优势，人们采用这一机理成功的设计开发了大量的并用于检测金属离子、阴离子、小分子等的荧光探针。^19、20但遗憾的是，只有极少数基于开环机理的荧光素衍生物被设计成H₂S荧光探针并用于活细胞成像。^21-24因此，我们设计合成了一种新的基于荧光素内酯开环的荧光探针，并将其应用在活细胞内H₂S的检测成像。荧光素两个羟基用1-溴-2,4-二硝基苯保护起来，通过与H₂S反应脱去保护、荧光素开环，实现了荧光从无到有的过程。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够识别细胞内H₂S的荧光素类荧光探针。 

本发明的技术方案是，一种荧光素类检测H₂S的荧光探针，结构式如下： 

本发明所述荧光素类检测H₂S的荧光探针的制备方法，包括以下步骤： 

3',6'-双（2,4-二硝基苯氧基）-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮的合成：在无水二甲基甲酰胺中按摩尔比1:2.2～1:4.4加入荧光素、1-溴-2,4-二硝基苯，室温条件下搅拌反应过夜，TLC跟踪至反应结束；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到3',6'-双（2,4-二硝基苯氧基）-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。其合成路线如图1所示。