[发明专利]一例大鼠胰岛上皮样干细胞系

说明书

技术领域

本发明涉及人类和其它哺乳动物胰岛干细胞系及其特征，特别涉及一例大鼠胰岛上皮样干细胞系及其形态、生长、表达和分化等特征，属于动物细胞（组织）工程领域。

背景技术

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是危害人类健康的重大疾病之一，据统计目前全世界糖尿病患者已达3.46亿(Am J Stem Cells.2012,1(3):196-204.)，而传统的药物及胰岛素替代疗法却不能从根本上医治该病。近十年来，随着移植技术的发展，胰岛移植治疗糖尿病取得了一定的疗效（N Engl J Med.2000,343(4):230-238. Diabetes.2005,54(7):2060-2069. Am J Transplant.2008,8(11):2463-2470. Immune Netw. 2013,13(6):235-239.）。但是，由于供体来源短缺，胰岛移植治疗糖尿病技术的应用受到制约。胰岛干细胞是存在于胰腺内分泌组织胰岛中的成体干细胞，能自我更新并具有多分化潜能。体外分离克隆胰岛干细胞，诱导其分化形成功能性胰岛，并移植治疗糖尿病是有效解决供体短缺的途径之一。目前，建立胰岛干细胞系，研究胰岛干细胞分化形成功能性胰岛移植治疗糖尿病已成为焦点。国外，Zulewski等（Diabetes.2001,50(3):521-533.Endocrinology.2002,143(8):3152-3161.StemCells. 2004,22(7):1134-1141.）首先报道胶原酶消化大鼠或成人胰腺组织分离获得单个细胞和胰岛，RPMI1640培养液悬浮培养，96h后，挑出悬浮胰岛，培养液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF贴壁培养，上皮样胰岛干细胞克隆性生长。其中，大鼠胰岛干细胞8.5个月扩增了10倍，人胰岛干细胞8个月扩增了7倍。免疫化学反应显示胰岛干细胞表达巢蛋白（nestin），不表达insulin、glucagon、somatostatin和CK19。体外定向诱导，胰岛干细胞分化形成胰腺导管细胞，表达CK19；分化形成胰岛细胞，表达insulin、glucagon等；分化形成肝脏细胞，表达α-甲胎蛋白；分化形成神经细胞，表达神经细胞特异性粘附分子。移植在小鼠肝脏内，人源性胰岛干细胞分化形成人肝脏细胞。Maria-Engler等（J Endocrinol.2004,183(3):455-467.）胶原酶HI灌注消化成人胰腺主胰管，分离获得细胞和细胞团，密度梯度离心，双硫腙（dithizon，DTZ）活性染色检测，筛选出直径大于150μm胰岛，CMRL1066+10%FCS培养。共聚焦荧光显微观察和RT-PCR检测，培养24h，胰岛细胞团中仅有少量细胞表达nestin；培养60d，nestin⁺表达量显著增多。采用含10%FBS培养液培养nestin⁺细胞30d，表达insulin；而采用含1%FBS培养液培养nestin⁺细胞30d，则表达insulin、glucagon和somatostatin。因此，作者认为体外长期培养，人胰岛中的nestin⁺细胞具有干细胞特性。Humphrey等（Diabetes. 2003,52(10):2519-2525.）胶原酶消化人胎儿早期胰腺组织获得胰岛细胞团，贴壁培养，上皮样细胞扩增形成单层。构建nestin-GFP质粒，腺病毒转染，418筛选，纯化出nestin⁺细胞。RT-PCR检测nestin⁺细胞共表达波形蛋白。采用烟酰胺、HGF等体外定向诱导，nestin⁺细胞却不能分化形成表达Pdx1、insulin的β细胞，移植在无胸腺小鼠体内也不能分化形成功能性β细胞，分泌insulin。这表明nestin不是β细胞祖细胞的特异性标记物。Sugiyama等（Proc Natl Acad Sci USA.2007, 104(1):175-180.）胰蛋白酶消化小鼠胎儿胰腺组织，分离获得单个细胞。流式细胞术分选，获得共表达Ngn3、CD133和CD45f的胰岛干细胞。体外定向诱导，胰岛干细胞分化形成β细胞，分泌insulin。Ta等（Stem Cells.2006,24(7):1738-1749.）的研究表明在培养液中添加成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth facter, bFGF）、白细胞抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）和骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein-4, BMP4），均能促进成年小鼠胰岛干细胞扩增。Jin等（Proc Natl Acad Sci U S A. 2013,110(10):3907- 3912.）胶原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺组织获得单个细胞，CD133标记，流式细胞术分选，条件培养基培养，3w后，细胞克隆形成细胞团，RT-PCR检测克隆细胞表达CD133。培养液中添加RSPO1定向诱导，CD133⁺细胞分化形成表达Ngn3的胰岛干细胞和腺泡细胞。流式细胞术进一步分选出Ngn3⁺胰岛干细胞，体外定向诱导，分化形成β细胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。国内，效梅等（中国科学C辑:生命科学.2008,38(8):699-707. Science in China Series C:Life Science.2008,51(9):779-788. 分子细胞生物学报.2008.41(6): 450-457. 分子细胞生物学报.2008,41(6):457-464. 解剖学报.2009, 40(2):55-58. 中国兽医学报.2009, 29(2):191-195.）报道Ⅳ型胶原酶消化人胎儿胰腺组织，收集单个细胞和细胞团，低糖DMEM培养液培养。当原代上皮样胰腺干细胞长出后，0.25%胰蛋白酶消化液消化，传代。克隆环筛选出单克隆人胰腺干细胞，培养液中添加10ng/mLEGF扩增培养，建立人胎儿胰腺干细胞系。免疫化学反应和RT-PCR检测该干细胞表达Pdx1、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表达insulin、CD34、CD44及CD45。β-巯基乙醇诱导，分化形成神经细胞，表达NF蛋白。烟酰胺诱导，分化形成DTZ染色阳性，分泌insulin和C肽的功能性类胰岛。将诱导类胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延长寿命。阎志风等（中国组织工程研究与临床.2008,12(3): 485-489.）无菌取人胎儿胰腺组织，Ⅴ型胶原酶消化，分离得到胰岛样细胞团。挑出悬浮胰岛样细胞团贴壁培养，上皮样干细胞克隆性生长至单层，传代。生长曲线显示人胎儿胰岛上皮样干细胞传代第3d进入对数生长期，第6d进入平台期，细胞生长曲线呈”S”形。荧光免疫反应检测原代上皮样干细胞表达PCNA、Pdx1、nestin、CK19、insulin、glucagon和CD29，传代后，干细胞则不表达insulin、glucagon和CD29。白日星等（中国普通外科杂志.2004,13(10):746-749）胶原酶消化新生大鼠胰腺组织，组织碎片采用无血清RPMI1640培养液培养。培养36h，nestin⁺细胞贴壁生长。添加bFGF、EGF、N₂，nestin⁺细胞快速增长。培养18～24d，nestin⁺细胞分化形成类胰岛样细胞团，胰岛素释放实验检测，分泌insulin。冯若鹏等（中国农业科学.2007,(3).582-587. 农业生物技术学报, 2011.19(1): 9-17.）胶原酶消化胎猪胰腺组织分离获得胰岛，贴壁培养，胰岛干细胞快速增殖，传18代，建系。免疫化学反应显示胰岛干细胞表达CK19和α-actin，不表达nestin。无血清诱导，2w后，胰岛干细胞分化形成DTZ染色阳性的胰岛样细胞团，表达insulin和Glut2等胰岛素分泌细胞功能相关的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。将诱导细胞移植到糖尿病裸鼠腹腔内，可缓解其高血糖状况。目前，国内尚无建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的报道。本发明一例大鼠胰岛上皮样干细胞系及其特征，将为研究人类和其它哺乳动物胰岛干细胞提供依据，这对于进一步研究人类和其它哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病具有重要的意义。