[发明专利]增强型CIK细胞制备方法以及细胞制剂

说明书

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体地指一种增强型CIK细胞制备方法以及细胞制剂。

背景技术

过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性、非特异性抗肿瘤免疫效应细胞，直接杀伤肿瘤细胞或病毒的治疗方法。过继性细胞免疫治疗己进入临床应用，并成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)等，在众多的免疫细胞中，CIK细胞由于有杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药细胞同样敏感以及对正常骨髓造血前提细胞毒性更小等优良特点，广泛的应用于临床。

与其它免疫细胞相比，CIK细胞是己知的对肿瘤细胞杀伤活性最强的效应细胞之一。它是通过多种细胞因子的联合作用，由外周血单个核细胞培养而来的一群异质细胞。CIK细胞的数量和细胞毒活性直接决定了其在临床治疗中的效果。NKT细胞是CIK异质细胞群中最具细胞毒活性的细胞，其细胞表面同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子（即CD3⁺和CD56⁺），既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具备NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点。然而，在人的外周血中NKT细胞含量极低，仅为1%左右。根据实验观察，清除一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞。而1cm³大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。因此，依靠自身的免疫细胞无法达到杀灭肿瘤的效果，只能通过体外培养，提高这类细胞的绝对数量。

CIK细胞能通过体外诱导而大量增殖，一般的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ处理24小时后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增值倍数和细胞毒活性都不够理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种高增殖力、高细胞毒活性的增强型CIK细胞制剂制备方法以及细胞制剂，该CIK制剂在保存时间上有显著提高。在室温情况下从6小时提高到36小时。在临床应用中可靠性更高，安全性得到有效保障。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种增强型CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到1～3×10⁶个/ml的单个核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；

其中：所述IFN-γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml；

2）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL-2的浓度：10～10000IU/ml，IL-1α的浓度：1ng～50μg/ml；IL-4的浓度：1ng～1μg/ml；GM-CSF的浓度为100～10000U/ml；

3）培养3～5天后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×10⁶/ml，其中：所述IL-2的浓度：10～10000IU/ml；

4）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。

进一步地，所述增强型CIK细胞的细胞密度：1～6×10^6-8个/ml

作为优选方案，增强型CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到1×10⁶个/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：2000IU/ml，PHA的浓度：100ng/ml，PGE2的浓度：50μg/ml；