[发明专利]一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸

说明书

技术领域

  本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆于大理洱源热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶，以及编码此酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法和应用。

背景技术

猪的乳汁中含有约3~5％的乳糖，当乳猪仔小肠粘膜绒毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足时会发生乳糖消化不良，未分解吸收的乳糖进入结肠后，被肠道存在的细菌发酵成为小分子的有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等，并产生一些气体如甲烷、H₂、CO₂等，这些产物大部分可被结肠重吸收，而未被吸收者或仍未被分解的乳糖可引起肠鸣、腹胀、腹痛、排气、腹泻等症状，长期如此并会严重影响乳猪仔的生长。

豆粕是畜禽饲料中常用的植物蛋白原料，而豆粕中含有较高的乳糖，饲料中的乳糖消化不良同样会引起腹胀和腹泻等症状。β-半乳糖苷酶（β-D-半乳糖苷酶，EC.3.2.1.23）又名乳糖酶，是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，可作为乳糖降解和双糖合成的催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用。早在50年代初Aronson和Pazur就报道了此酶的转糖苷活性，乳糖酶转糖苷作用生成低聚半乳糖等功能糖。这种转移反应的产物是双糖、三糖和分子再大一些的低聚糖，是有多重组分构成的混合体系。我们所说的低聚半乳糖是以高浓度乳糖作为β-半乳糖苷酶的底物而生成的，是在乳糖分子的半乳糖残基上以β键接上1~4个半乳糖而形成的杂低聚糖。低聚糖几乎不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维，只能被双歧杆菌所利用，双歧杆菌是肠内最有代表性的有益菌，它能调节和恢复肠道内微生态菌群的平衡、抑制肠内有害菌及病原菌的繁殖、促进肠蠕动、防治便秘及下痢、增进矿物的吸收和维生素的合成、提高机体抗病免疫功能等。功能糖是双歧杆菌、乳酸杆菌最直接、最有效的养料，它能排除消化系干扰，选择性地进入到双歧杆菌、乳酸杆菌最适宜生长的大肠，促使双歧杆菌快速生长和大量繁殖，增强机体免疫力的作用。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。

发明内容

本发明旨在提供一种高温β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，本半乳糖苷酶来源于大理洱源热泉宏基因组。

本发明的另一个目的是提供含有编码β-半乳糖苷酶的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种重组载体，其含有编码β-半乳糖苷酶的多核苷酸，且其是由多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成。

本发明的有益效果如下：

本发明获得的β-半乳糖苷酶，该半乳糖苷酶在37-55℃具有较高的催化活性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，能有效治疗乳猪小肠粘膜绒毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足发生乳糖消化不良引起的腹泻，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用；另外该酶还具有转糖苷作用，在高浓度的乳糖作为底物时，该酶的转糖苷作用能催化一种功能低聚糖---低聚半乳糖的生成，低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增值因子，只能被双歧杆菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌（入产气荚膜梭菌）的生长，减少毒素和酶的产生，有整肠效果。

附图说明

图1为本发明β-半乳糖苷酶基因的克隆片段；

图2为本发明β-半乳糖苷酶基因保守结构域分析示意图；

图3为本发明β-半乳糖苷酶基因与表达质粒连接菌落PCR检测，图中：M为Marker，泳道1~8皆为转化后挑取的8个转化子；

图4为本发明构建成功的重组质粒双酶切图谱，图中：M为marker，泳道1~3为三个构建好的重组质粒；

图5为本发明β-半乳糖苷酶基因表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图，其分子量约为92000道尔顿，图中：M为Protein Marker，泳道1为pET32a-GAL/Rosetta诱导前破碎上清，泳道2为pET32a-GAL/Rosetta诱导后破碎上清，泳道3为pET32a-GAL/Rosetta诱导后破碎上清过柱透过液，泳道4为30mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道5为50mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道6为80mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道7为150mM咪唑缓冲液过柱第一管，泳道8为300mM咪唑缓冲液过柱第一管；

图6为本发明温度对β-半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；

图7为本发明β-半乳糖苷酶对温度的稳定性结果示意图；

图8为本发明pH对β-半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；