[发明专利]一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法

权利要求书

1.一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

（1）提供一大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置，安装、连接整套装置并进行高温灭菌；所述大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置包括：储液装置、转染复合物混合装置、细胞培养装置、中央控制装置、细胞截留装置、上清液收集装置、细胞收集装置、若干液体无菌推动装置和若干可控速液体流动管道，上述各装置的连接方式为：储液装置通过一第一可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在储液装置与细胞培养装置之间设有一第一液体无菌推动装置；转染复合物混合装置通过一第二可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在转染复合物混合装置与细胞培养装置之间设有一第二液体无菌推动装置；细胞培养装置与中央控制装置通过信号转化输出线相连；细胞培养装置的一端通过一第三可控速液体流动管道与细胞截留装置的截留前部分相连，细胞培养装置的另一端通过一第四可控速液体流动管道与截流后的细胞截留装置相连，在细胞培养装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第三液体无菌推动装置；细胞截留装置截留前一端与上清液收集装置相连，在上清液收集装置与截流前的细胞截留装置之间设有一第四液体无菌推动装置；细胞截留装置截留后另一端通过一第五可控速液体流动管道与细胞收集装置相连，在细胞收集装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第五液体无菌推动装置；其中，所述细胞截留装置至少设有细胞混合液入口、细胞上清液出口、细胞回流出口、截留出口，其中细胞混合液入口与细胞培养装置连接，用于将从细胞培养装置中排出的细胞混合液中的细胞进行截留，所述第三可控速液体流动管道设置在所述细胞混合液入口与细胞培养装置之间；细胞上清液出口经所述第四液体无菌推动装置与上清液收集装置连接，使细胞截留装置中的细胞上清液通过所述第四液体无菌推动装置被推入到上清液收集装置中；细胞回流出口经所述第三液体无菌推动装置连接细胞培养装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过第三液体无菌推动装置被推入细胞培养装置中；截留出口经所述第五液体无菌推动装置连接于细胞收集装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过所述第五液体无菌推动装置被推入到细胞收集装置中；其中，所述可控速液体流动管道为可通过滑动控制阀或夹子控制培养液流速的管道；所述液体无菌推动装置为蠕动泵；

（2）无菌条件下向细胞培养装置中泵入无菌培养液，培养液的量至少能没过检测温度、溶氧、pH的探头，然后进行无菌检测；

（3）在无菌条件下，向细胞培养装置中接种事先培养的、状态良好的待转染的细胞，根据不同细胞、不同质粒确定最佳转染条件，在所述最佳转染条件下将DNA、转染介导试剂、细胞转染液在转染复合物混合装置中孵育并将得到的转染复合物加入到细胞培养装置中；其中，所述最佳转染条件包括质粒浓度，转染试剂与质粒浓度比例，孵育时间；

（4）根据培养细胞的生长特性和细胞培养装置的工作体积，将细胞培养装置的反应器各项理、生、化指标设定在细胞培养和蛋白表达的最佳条件，同时通过中央控制装置控制系统灌注参数，所述系统灌注参数包括反应器的灌注、回流速度、废细胞排出速度；细胞培养装置中的细胞通过细胞截留装置后，启动细胞截留装置的无菌推动装置，将生长快慢不同的细胞均匀的推入细胞截留装置中并根据细胞生长状态需要，部分回流至细胞培养装置中，同时收集上清液进行重组蛋白的检测和纯化；

（5）按照具体的蛋白表达水平的变化，在灌注培养一定时间后，再次加入适量的转染复合物，按照上述步骤（3）中的转染条件再次转染，此过程重复至少一次；

（6）每个工作周期收集细胞培养液进行蛋白含量的检测和后续重组蛋白纯化处理，收集足够的蛋白后，终止细胞培养和蛋白表达过程。

2.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，待转染的细胞的接种细胞密度为0.05～1×10⁷个细胞/mL。

3.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，最佳转染条件包括：质粒DNA浓度为0.5-3μg/mL，质粒DNA:转染试剂比例为1:2-10，孵育时间为5-30分钟，以形成稳定的DNA-转染介导试剂复合物。