[发明专利]一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法。

背景技术

干细胞与再生医学是近几年生物医学的重要研究领域，具有重大的临床应用价值。多能干细胞可分化为各种组织器官的功能性细胞，可用来研究人类发育、制作疾病模型，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机体创伤修复、治疗疾病。干细胞与再生医学将改变传统对于坏死性和损伤性等疾病的治疗手段，对疾病的机理研究和临床运用带来革命性变化。如何保证并提高干细胞的安全性是再生医学中的关键问题。常规的外源基因表达方法有几个缺陷。干细胞分化经常需要几周的时间，以DNA质粒为主的瞬时表达系统仅能维持几天，无法完成分化上的时间要求。以逆转录病毒和慢病毒为工具的表达系统虽然维持时间长，但病毒会整合入人类基因组中，造成基因突变，甚至可能导致癌症的发生^[1]。因此，建立一套高效、非整合性的长时间基因表达系统既可以作为干细胞科研的有利工具，也可以弥补DNA质粒、逆转录病毒和慢病毒系统功能上和安全性方面的缺陷，用于再生医学和基因治疗。

Episomal系统是现有的一种哺乳细胞基因表达系统，含有oriP/EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列^[2]。oriP/EBNA1取自Epstein-Barr病毒，其特性为，可以结合人类细胞的DNA复制蛋白，使所连接的DNA能够在宿主细胞染色体外稳定复制，但不会整合到宿主细胞基因组中造成突变，因此为非整合基因表达系统^[3]。此外，Episomal系统可以在人类细胞中自我复制，因此表达时间长，可达几周至数月，但由于其非整合的特性，最终会被宿主细胞丢失^[4]。同时这些载体无需病毒包装就能转染，避免了病毒制作的复杂过程。

由于Episomal质粒具有非整合性和长时间表达的特性，因此安全性高，在干细胞和再生医学领域具有很好的应用前景。Episomal质粒也有一定的缺点，如在人类细胞系中表达的效率较低。

1.Daniel,R.and J.A.Smith,Integration site selection by retroviral vectors:molecular mechanism and clinical consequences.Hum Gene Ther,2008.19(6):p.557-68.

2.Wang,J.and B.Sugden,Origins of bidirectional replication of Epstein-Barr virus:models for understanding mammalian origins of DNA synthesis.J Cell Biochem,2005.94(2):p.247-56.

3.Yu,J.,et al.,Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science,2009.324(5928):p.797-801.

4.Keisuke O.,et al.,A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.Nature Methods,2011.8(5):p.409-412

发明内容

本发明的目的是提供一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法。

本发明提供的EBNA-D500DNA分子，该分子的序列如SEQ ID No.1所示。

EBNA-D500mRNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No.2所示。

一种提高外源基因在哺乳动物细胞中表达效率的试剂盒也属于本发明的保护范围，包括所述的EBNA-D500DNA分子或所述的mRNA分子和Episomal质粒；

所述Episomal质粒中文名为“非整合型附着体质粒”，即含有OriP/EBNA(Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列的质粒，其中OriP为顺式结构，EBNA为反式结构，该质粒可作为任何哺乳动物细胞表达载体。

所述试剂盒中包括使用说明书，使用说明书中记载如下内容：将外源基因插入Episomal质粒的多克隆位点，得到重组质粒；将重组质粒与所述的EBNA-D500mRNA分子共同转染目的哺乳动物细胞；

或，