[发明专利]一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器及制备方法

权利要求书

1.一种用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器，包括绝缘性基体、形成在该基体上的含有工作电极、参比电极和对电极的电极系统，其特征在于，所述工作电极上固定有生物酶层，该生物酶层包括磁性纳米粒子修饰的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及电子传递体，所述磁性纳米粒子的直径为250nm～350nm。

2.如权利要求1所述的酶传感器，其特征在于，所述磁性纳米粒子为镍修饰磁性纳米粒子，而所述PP2A酶蛋白质链氨基末端修饰有能与所述镍修饰磁性纳米粒子共轭链接的hexa-His。

3.如权利要求2所述的酶传感器，其特征在于，所述镍修饰磁性纳米粒子的直径为300nm。

4.如权利要求1所述的酶传感器，其特征在于，所述电子传递体为对硝基苯磷酸二钠盐。

5.如权利要求1或2或4所述的酶传感器，其特征在于，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为石墨电极。

6.一种如权利要求2所述的用于检测大田软海绵酸的基于磁性纳米粒子修饰的酶传感器的制备方法，其特征在于，首先将镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接形成磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，然后将该磁性纳米粒子修饰的PP2A酶通过光交联法或琼脂糖包埋法固定在所述工作电极上。

7.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述镍修饰的磁性纳米粒子与所述PP2A酶偶联吸附连接包括以下步骤：

（1）将15～30ul的Ni-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液加入到预装有150～300ul结合缓冲液的容器中，并用所述结合缓冲液清洗，以去除非特异性结合，所述结合缓冲液的pH为8-8.5，含有Tris–HCl、NaCl以及叠氮化钠；

（2）将1～2个单位PP2A酶/ul的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600～1000转/min的转速震摇所述容器10-20min，以使所述磁性纳米粒子与所述PP2A酶充分偶联吸附结合形成磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，所述PP2A酶溶液与所述NI-IDA磁性纳米粒子胶状悬浮液的体积比为50～100:3，所述1单位PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（3）用所述结合缓冲液清洗所述磁性纳米粒子，以去除未结合的所述PP2A酶。

8.如权利要求7所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述结合缓冲液为pH7.5的20mM Tris溶液，该Tris溶液含有500mM NaCl和0.09%叠氮化钠。

9.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述光交联法包括以下步骤：

（1）将所述磁性纳米粒子修饰的PP2A酶溶解在pH8～8.5缓冲液A中制成1～2个单位/ul的固定酶溶液，在该酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶与所述PVA-AWP的质量比为1～2:1，均质后形成固定溶液，所述缓冲液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液至工作电极表面，3～5℃下在功率为12～15W的日光灯下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的磁性纳米粒子修饰的PP2A酶，最后将制得的固定化磁性纳米粒子修饰的PP2A酶电极在4℃下保存备用。

10.如权利要求6所述的酶传感器的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖包埋法包括以下步骤：

（1）将0.1～0.2g琼脂糖加入到50～100ml pH为8～8.7的Tris–HCl缓冲液中，55～65℃加热4～6min，充分溶解后得琼脂糖溶液，待该琼脂糖溶液降温至20～27℃时，将磁性纳米粒子修饰的PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成混合液，该混合液中磁性纳米粒子修饰的PP2A酶的浓度为1～2个单位PP2A酶/ul，其中所述1单位磁性纳米粒子修饰的PP2A酶为在25℃下1min内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；

（2）上述混合液3～5℃放置11～13h后，取2.5～3.5ul滴涂于所述工作电极表面，室温下干燥成膜5～6h；

（3）干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后将制得的固定化磁性纳米粒子修饰的PP2A酶电极在4℃下保存备用。