[发明专利]用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒。

背景技术

烟草普通花叶病（TMV，tobacco mosaic virus)是全世界烟草栽培区发生普遍、危害严重的一大病害。发病后，烟叶产量降低，品质变劣，对烟叶生产带来极大危害。目前，对于TMV的防治没有效果较好的药剂，只能采取提前预防、综合防治等措施，由于受耕地资源紧张、连作的影响，培育抗TMV的烟草品种在生产中显得尤为迫切和重要。

N基因起源于野生种黏烟草（Nicotiana glutinosa），是目前已经明确的烟草抗TMV基因，是烟草抗TMV育种的主要抗源。1938年，F.Q.Holmes等研究表明，黏烟草对TMV的抗性是由显性单基因N基因控制的；1994年，S.Whitham等通过转座子标签法克隆得到N基因，并证明其介导的TMV抗性可以产生过敏性坏死反应。N基因全长为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，编码NS和NL两种转录产物，属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。国外已经利用N基因介导的TMV抗性育成了一批高抗TMV的烟草品种，包括Ky56、By21、NC75、VA770、TN86、Coler176、Coker86等。我国也利用该抗源培育了一系列抗TMV品种（系），如：利用Ky56作为亲本育成了辽烟8号、辽烟10号等抗TMV品种；利用Coker86的抗病性，育成了辽烟13、辽烟14等抗TMV品种。这些品种在我国的烟草生产中发挥了重要作用。

在传统的抗TMV育种中，为鉴定所培育的品种是否具有TMV抗性，通常采取田间鉴定方法，即：需要对育种材料进行单株接种并创造合适的发病条件，因此，如果接种不成功或条件不合适，均会影响品种抗性判断结论，具有品种抗性判断效率低的不足。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒，利用N基因特异引物序列检测不同育种材料TMV抗性，为烟草抗TMV育种提供一条快捷有效的方法，不受生长条件和发育时期的影响，可以快速高效的检测N基因控制的TMV抗性，加快抗TMV种质资源和优良品种筛选，还具有操作简便、结果可靠、检测速度快等优点，能够极大地加速材料的选育过程，缩短育种周期，提高育种效率。

本发明采用的技术方案如下：

本发明第一目的为提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对，包括上游引物NPF和下游引物NPR；

所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第二目的为提供一种烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，包括以下步骤：

S1，利用Genbank提供的烟草基因组序列进行Blast比对，查找被检测烟草的N基因序列特异区域，并在该特异区域设计N基因特异性引物对；其中，所述N基因特异性引物对包括：上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

N基因序列特异区域的序列如下：