[发明专利]抗牛γ干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛γ干扰素的双抗体夹心ELISA试剂盒。

背景技术

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），一般由干扰素诱导剂诱导产生，它是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，其类型分为三类，α-（白细胞）型、 β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

干扰素（IFN）作为一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。 

牛结核病是由牛结核分枝杆菌所引起的一种慢性消耗性传染病，可通过病畜传播给人类或其它动物。结核病除了感染人外，还能感染50多种哺乳动物和20多种禽类。牛结核病在世界各国均有发生，在我国依然是常见的多发性疾病，其传播流行不但影响到畜牧业的持续发展，更严重影响着人类的健康。目前，国内外用于诊断牛结核病的检验方法，大体上可分为三类：一是细菌学检验方法，如涂片镜检、细菌培养和动物接种等；第二类为采用分子生物学检验方法，如生物探针法、PCR法等；第三类是采用免疫学方法检测，如皮内变态反应、ELISA和ELISPOT法等。皮内变态反应曾在牛结核病的诊断与防治过程中发挥了重要的作用，但该方法的欠缺之处在于干扰结核病检疫的因素很多，既有物理性的，也有化学性的，更多的是非典型分支杆菌的干扰，因为各分支杆菌均表现出相互交叉的变态反应，常造成非特异性反应的发生。世界各国都倾力于牛结核病的快速诊断方法研究，建立了一些新型、快速、准确、可靠的检测方法，并在这个领域取得了瞩目的进展。20世纪90年代Wood等证明牛结核分枝杆菌侵染机体后会刺激机体淋巴细胞形成记忆淋巴细胞，使淋巴细胞致敏，将无菌采集到的牛血用牛结核分枝杆菌的特异性抗原（BPPD）再次刺激，就会导致全血中的致敏淋巴细胞被活化，释放出大量的γ-干扰素，因此可以通过检测牛全血上清中的γ-干扰素来达到检测牛结核病的目的。这种全血γ干扰素测定法已显示出能为人、猴、牛、水牛、绵羊和山羊等动物一系列疾病的诊断提供快速灵敏的手段，并且牛γ干扰素测定法的广泛性田间试验已在世界上许多国家（包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国）完成，正逐步取代结合菌素皮内试验，γ-干扰素诊断法的敏感性为81.8％～100％，特异性为94％～100％，比皮试更敏感。然而，建立快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法的关键是高特异性和亲和力的单克隆抗体的获得。

发明内容

本发明目的是提供一种快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法的检测牛γ干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒。

本发明包括：

    (1) 包被抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1(捕获抗体)的酶标板；

(2)  酶标记抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5(检测抗体)；

其中，包被在酶标板的抗牛γ干扰素单克隆抗体与酶标记抗牛γ干扰素单克隆抗体分别针对牛γ干扰素不同表位。 

此外，本发明试剂盒还可以包括以下试剂中的一种或多种：稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液等。

运用本发明检测试剂盒可检测天然的牛γ干扰素，以及人工表达的重组牛γ干扰素。本发明为牛细胞免疫研究和牛结核病的快速检测提供了可靠的手段。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，适合大规模推广应用。

本发明以合成肽和GST-牛γ干扰素纯化的蛋白作为抗原制备抗牛γ干扰素单克隆抗体，得到一系列不同抗原表位的单克隆抗体，通过进一步筛选，结果获得2株针对牛γ干扰素抗原不同表位的杂交瘤细胞株，该细胞株分泌的单克隆抗体效价高，特异性强，检测反应性效果好。

本发明为牛γ干扰素的快速检测提供了可靠的手段。该试剂盒操作简便、快速，可以用于牛细胞免疫学研究和牛结核病的快速检测。适用于高等学校，科研单位、市级以上兽医部门和出入境检验检疫局的科学研究和牛结核病的检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

本发明还提出以上试剂盒的制备方法：

从杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma-3E1分泌获得抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1，从杂交瘤细胞株Bovin IFN gamma-6E5分泌获得抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5，将抗牛γ干扰素单克隆抗体3E1包被在酶标板上，在抗牛γ干扰素单克隆抗体6E5上进行酶标记。