[发明专利]检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物药物的残留量。

背景技术

氟喹诺酮类药物因其抗菌谱广、抗菌活性强，已成为临床上常用的抗菌药物，但由于药物本身特性及不合理用药和滥用药物现象的存在，引起了一系列的不良反应。常见的有皮肤过敏及光敏反应、中枢神经系统反应、循环系统反应、消化系统反应、泌尿系统反应、呼吸系统反应、软骨毒性、肝脏毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激症状等，养殖业将其作为添加剂饲养动物，使该类药物在动物体内有一定残留量，因此对人类健康造成了一定的危害。美国、欧盟、中国等都对氟喹诺酮类药物的残留限量做出了规定。

目前，氟喹诺酮类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法等仪器方法。这些方法具有灵敏度高、结果准确等优点，但是资金和人员等投入成本较高。本发明应用酶联免疫法，测定蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋中氟喹诺酮类药物药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、氟喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、氟喹诺酮类药物特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为氟喹诺酮类药物偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。

所述氟喹诺酮类药物偶联抗原是由氟喹诺酮类半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氟喹诺酮类半抗原是由诺氟沙星和羧甲基羟胺反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述氟喹诺酮类药物特异性抗体是以氟喹诺酮类药物偶联抗原作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物特异性抗体可为氟喹诺酮类药物单克隆抗体或氟喹诺酮类药物多克隆抗体，其中优选氟喹诺酮类药物单克隆抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是采用改良后的过碘酸钠法进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氟喹诺酮类药物标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述氟喹诺酮类药物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%～1.0%吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述蜂蜜样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1%～3%酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：