[发明专利]检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法

权利要求书

1.用于引导登革病毒基因反转录的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一条：

用于引导登革I型病毒基因反转录的引物DV1-RTP，其序列为SEQ ID No：1所示；

用于引导登革Ⅱ型病毒基因反转录的引物DV2-RTP，其序列为SEQ ID No：2所示；

用于引导登革Ⅲ型病毒基因反转录的引物DV3-RTP，其序列为SEQ ID No：3所示；

用于引导登革Ⅳ型病毒基因反转录的引物DV4-RTP，其序列为SEQ ID No：4所示。

2.用于扩增登革病毒目的片段的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一对：

用于扩增登革 I 型病毒目的片段的引物对DV1-F和 DV1-R，其序列分别为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；

用于扩增登革Ⅱ 型病毒目的片段的引物对DV2-F和 DV2-R，其序列分别为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；

用于扩增登革Ⅲ 型病毒目的片段的引物对DV3-F和 DV3-R，其序列分别为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；

用于扩增登革Ⅳ型病毒目的片段的引物对DV4-F和 DV4-R，其序列分别为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12。

3.用于检测登革病毒分型的探针，其特征在于所述探针包括如下                                                至 中的至少一种：

 用于检测登革I型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：13 所示；

 用于检测登革II型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：14 所示；

 用于检测登革III型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：15 所示；

 用于检测登革IV型病毒的探针，其序列为SEQ ID NO：16 所示。

4.一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

1）合成权利要求2所述引物及权利要求3所述探针，并对探针分别标记；

2）提取待测样品RNA，反转录形成cDNA模板；

3）以步骤1）所述引物对cDNA模板进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

4）将 PCR 扩增产物与步骤1）中合成的探针杂交，得杂交产物；

5）检测杂交信号并分析结果。

5.根据权利要求4所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：

所述步骤1）合成引物后，对每对引物中的下游引物在5’端进行生物素标记；所述对探针的标记为对所有探针在5’端进行胺基化修饰，连接C12邻接臂序列，并与相应荧光编码的微球偶联，然后将偶联有不同探针的微球混合，制成探针微球组；

所述步骤4）PCR 扩增产物与探针杂交后，对杂交产物进行SA-PE标记，得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；

所述步骤5）对杂交信号的检测采用液相芯片系统。

6.根据权利要求5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤1）探针微球组中偶联不同探针的微球个数相等。

7.根据权利要求5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤5）对杂交信号的检测采用Bio-Plex^TM 200检测系统。

8.根据权利要求4或5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：步骤2）反转录形成cDNA时采用权利要求1所述的引物。

9.根据权利要求4或5所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤3）PCR扩增采用不对称扩增，PCR体系中下游引物浓度为上游引物浓度的3-6倍。

10.根据权利要求4所述的一种检测登革病毒及其分型的方法，其特征在于：所述步骤4）杂交反应的条件为96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。