[发明专利]一种测定蛋白质或其水解物中结合态谷氨酰胺含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蛋白质和其水解物中结合态谷氨酰胺含量的方法，属于分析技术领域。

背景技术

谷氨酰胺是蛋白质中的重要氨基酸，谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺化产物，对生物体尤其是动物体的代谢有重要作用。

目前蛋白质中氨基酸的分析均采用酸水解法，即通过盐酸将蛋白质水解为游离的氨基酸，然后采用色谱技术（离子交换或反相色谱）分离和测定氨基酸的含量。但酸水解时蛋白质中的谷氨酰胺和天门冬氨酸分别水解为谷氨酸和天门冬氨酸，而这两种氨基酸也是蛋白质中固有的氨基酸，色谱方法测定的谷氨酸实际上是蛋白质中固有谷氨酸和谷氨酰胺酸解转化生成谷氨酸的总和（天门冬氨酸分析结果也是如此）。因此，在目前的国内外文献中很少报道蛋白质中谷氨酰胺和天门冬酰胺的含量。

上个世纪九十年代国外报道BTI试剂可以与蛋白质中的谷氨酰胺反应转化成L-2,4-二氨基丁酸(DABA)，该成分对酸稳定，可以抵抗盐酸的水解，从而使得蛋白质中结合态谷氨酰胺含量的测定成为可能。

但目前文献中利用BTI试剂保护法测定蛋白质中谷氨酰胺含量的过程是：先利用丙氨酰-谷氨酰胺二肽（Ala-Gln）或甘氨酰-谷氨酰胺二肽(Gly-Gln)作为标准品，它们与BTI试剂反应后生成DABA，然后通过氨基酸衍生试剂与DABA反应，并用色谱法测定DABA的含量，计算出Gly-Gln或Gly-Gln二肽与DABA之间的换算关系。蛋白质样品也与上述二肽做相同处理，通过测定生成的DABA含量计算样品中的谷氨酰胺含量。可以看出，此类方法速度慢，成本高，操作繁琐，不利于推广和实际应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有谷氨酰胺含量测定方法速度慢，成本高，操作繁琐，整个测定过程需要丙氨酰-谷氨酰胺二肽和甘氨酰-谷氨酰胺二肽做标准品的缺点，提供一种简单，快速，灵敏度高的蛋白质或其水解物中结合态谷氨酰胺含量的测定方法。

为实现本发明目的，技术方案通过以下步骤实现：

 (1)样品的溶解：取蛋白质或其水解物溶于蒸馏水中，45℃～55℃水浴中搅拌使之充分溶胀。

(2) 样品的BTI（双(三氟乙酰氧基)碘苯）保护处理(TS)：取步骤（1）样品液，加BTI溶液和吡啶溶液，于50℃～55℃水浴保温。然后，再于60℃～80℃水浴或充氮气蒸干。

(3) 对照样品处理(CS)：取步骤（1）样品液，加乙腈溶液和吡啶溶液，于50℃～55℃水浴保温。然后，再于60℃～80℃水浴或充氮气蒸干。

 (4) 酸水解：在含有（2）、（3）样品的消化管中加入酸，封口后完全水解。再定容、过滤。

(5)衍生和上柱分析：取步骤（4）水解液，用氨基酸衍生化试剂衍生和上柱。

(6)实验结果的处理：以样品质量为基数，通过氨基酸色谱分析并计算， BTI保护样品(TS)和对照样品(CS)中的谷氨酸百分含量之差即为结合态谷氨酰胺含量。

所述方法中，每1.0～3.0 mL样品液，加入50 μ moL/mL的吡啶溶液0.1～0.5mL，10 mg/mL的BTI溶液1.0～5.0 mL，1.0～5.0 mL乙腈溶液。

酸水解所用的酸优选盐酸、醋酸，其浓度4～8moL/L，每1.0～3.0 mL样品液，加入1.0～5.0 mL。

衍生和上柱分析使用的氨基酸衍生化试剂优选2.4-二硝基氟苯（DNFB）、苯异硫氰酸酯（PITC）、邻苯二甲醛（OPA）、6-氨基喹啉-N-(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯（AQC）或茚三酮。

本发明的测定原理如下：根据蛋白质或肽分子中结合态谷氨酰胺经BTI反应后不被盐酸水解的特点，借助BTI试剂保护、再经过酸水解后测定谷氨酸含量，并与未经BTI保护样品中谷氨酸含量的差异，计算蛋白质或肽分子中结合态的谷氨酰胺含量。

本发明创新点在于：一是仅仅将蛋白质中的谷氨酰胺与BTI试剂反应转化成对酸稳定的DABA； 二是不用价格较贵的Gly-Gln或Gly-Gln二肽标准品，通过BTI保护和未保护蛋白质样品经过盐酸水解后的谷氨酸测定值之差计算结合态谷氨酰胺含量（谷氨酸和谷氨酰胺的分子量分别为147.13和146.15），具有快速、准确和稳定的特点；三是目前氨基酸分析中任何一种衍生化试剂（如DNFB、PITC、OPA、AQC、或茚三酮等）均可使用，不需要考虑该衍生化试剂与DABA的匹配性，因而，其应用更灵活和方便。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。