[发明专利]梅岭霉素合成基因簇中酮还原酶MeiF在手性芳香醇生产中的应用

说明书

本发明公开了一种表达纯化酮还原酶MeiF生物制备手性芳香醇的方法，及其在以芳香酮为底物生物制备手性芳香醇中的应用。以纯化的该酮还原酶和葡萄糖还原酶GDH作为催化剂，在只需要添加NADP+的条件下实现了以芳香酮为底物高效生物制备手性芳香醇。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及南昌链霉菌(Streptomycesnanchangensis)中梅岭霉素(Meilingmycin)合成基因簇中的酮还原酶MeiF及其编码基因meiF，含有该基因的表达载体和含有该表达载体的克隆菌株及表达菌株，及酮还原酶MeiF的表达及制备方法，还涉及酮还原酶MeiF作为催化剂在制备手性芳香醇中的应用。

背景技术

手性制药业是目前医药行业的前沿领域，而手性药物已在世界医药市场占有重要的份额，成为国内外上新药研究的热点。对于手性药物而言，其中的一个异构体有效，另一个异构体可能就无效甚至是有害。手性制药具有很多优势：临床上，对映体纯的手性药物既可以排除无效对映体所引起的毒副作用，也能减少药剂量和人体对无效对映体的代谢负担，提高药物的专一性。因而具有十分广阔的市场前景和巨大的经济价值。手性药物的前体一般是手性醇，像手性芳香醇类在药物工业有重要的应用，可分别作为合成(R)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等多种治疗神经系统、心血管等疾病的手性药物的重要中间体。手性芳香醇一般可以利用从天然产物中提取、外消旋体拆分法、化学合成和生物合成等方法生成。相对于其他手性芳香醇的合成方法，生物酶催化的反应条件温和，无需强酸或强碱、极端温度和压力；立体选择性好，可避免因反应条件苛刻而导致的消旋化、异构化及重排等副反应，也免除了传统有机合成中通常为了阻断不必要的副反应而需要的基团保护和去保护措施；反应效率高，能大幅度加快反应速度。同时酶催化反应一般不会产生毒副产物，在环境污染问题上比传统化学合成方法要小得多，具有广阔的应用前景和商业价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是重组大肠杆菌表达酮还原酶MeiF制备手性芳香醇的方法。

为解决上述技术问题，设计技术方案如下：

用于不对称制备手性芳香醇的重组大肠杆菌，是导入酮还原酶基因meiF的大肠杆菌。用于提供还原力NADPH的大肠杆菌为导入了葡萄糖脱氢酶GDH的大肠杆菌。

上述酮还原酶基因meiF含有813bp碱基，在Genebank中的收录号是FJ952082.1，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。有该基因编码的酮还原酶MeiF包含270个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述葡萄糖脱氢酶GDH基因含有786bp碱基，其在Genebank中的收录号为D50453.1，其基因序列如SEQ ID NO：3所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶包含261个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明从南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)基因组中克隆了酮还原酶MeiF编码基因，将其构建到表达载体pET28a上并在大肠杆菌中表达。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组中克隆了葡萄糖还原酶GDH的编码基因，并将其构建到表达载体pET28a上并在大肠杆菌中表达。表达所用的大肠杆菌是本实验室保藏的Ecoli BL21(DE3)。

构建上述重组大肠杆菌的方法如下：PCR克隆酮还原酶MeiF编码基因和葡萄糖还原酶GDH的编码基因，将其构建到pET28a上分别在大肠杆菌中表达，获得制备手性芳香醇的重组大肠杆菌。

构建的表达酮还原酶的大肠杆菌能以芳香酮为底物合成手性芳香醇，而所构建的葡萄糖脱氢酶GDH能以葡萄糖为辅助底物，使得NADPH循环再生，所以在反应中加入少量的NADP+就可以实现NADPH的高效循环利用。

酮还原酶MeiF及葡萄糖还原酶GDH的蛋白诱导表达条件如下：表达温度16度，摇床转速220rpm，IPTG浓度为0.3mM，表达时间为12-16小时。