[发明专利]一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，特别涉及一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒。 

背景技术

人们通常认为吗啡对高等哺乳动物而言是剧烈的毒品，仅能从植物中提取。但是经过深入研究表明，在低等软体动物和高等哺乳动物中，除神经肽，氨基酸及其他小分子神经介质传递机制外，还存在以内生吗啡类物质为介质的神经传递机制。人们的痛觉、精神上的愉快和抑郁以及生理上的快感，在一定程度上取决于大脑产生内生吗啡的多少，因此，内生吗啡的产生、增加及减少，在一些特定的情况下对疼痛有着不同的反应和感觉。 

之前的研究发现贻贝、龙虾等海洋软体动物神经节自身可产生微量的内生吗啡；在大白鼠大脑区的杏仁核区内存在内生吗啡，而且内生吗啡可使杏仁核区产生一氧化氮；在人的白细胞中也能检测到微量的内生吗啡。目前报道用于检测内生吗啡的方法主要高效液相色谱 (HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法 (HPLC/MS)。色谱法是目前国际上普遍采用的检测方法，灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，但其对仪器和操作人员要求都较高，成本也比较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不利于在基层单位推广使用。免疫分析法是国际上通用的一种生化方法。目前常用的胶体金法受所用的生物制剂的影响，假阳性出现的概率很高，而且由于胶体金法灵敏度低，颜色判断有人为因素致使准确性差。 

因此建立一种快速、灵敏、准确，并可以大批量应用于内生吗啡检测的方法是具有非常重要的现实意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种海水鱼内生吗啡的检测方法，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确。 

本发明还提供了一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，试剂盒具有保存时间长、自动化程度高、成本低、无放射性同位素污染、快速简便、灵敏度高、准确可靠等特点。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理

取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，沥干，然后将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入0.5-2ml甲醇，70-75℃水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液。

现有高效液相色谱的处理样品的方法用于本发明的检测样品的处理，无法检测到内生吗啡，因此，本发明首先改进了样品的前处理方法，以适合于下一步的试剂盒的检测。 

（2）试剂盒检测 

包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100-120μl/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液250-300μl/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120μl/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止液100-120μl/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。

（3）结果分析 

以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。

作为优选，所述样品稀释液为pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液。 

作为优选，所述吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。 

作为优选，所述显色剂为四甲基联苯胺。 

作为优选，所述终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。 

作为优选，包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1μg/ml得包被液，酶标板每孔加入100μl包被液，37℃孵育2h或者4℃过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。 

作为优选，所述洗涤液为含有体积分数0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液稀释10倍后所得。