[发明专利]大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒

权利要求书

1.一种大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物，其特征在于：由序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成，扩增产物为354bp：

SEQ ID NO.1：5- atgaataagaatctcatc-3

SEQ ID NO.2：5- tttcttctcgcagtttcg-3。

2.含有权利要求1所述引物的检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征是，试剂盒包括PCR预混液和DNA聚合酶，所述PCR预混液包括：

每22uL的反应体系包括10×PCR缓冲液2.5uL、2.5mM的dNTPs 2.0uL、25mM的MgCl₂ 1.5 uL、20pmol/uL碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.2 uL、超纯水15.6uL；

每个检测反应总体积25 uL，含有22uLPCR预混液，DNA聚合酶1 uL、待检DNA模板2uL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，用于检测大肠杆菌O157:H7的PCR方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：取粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如果待检样品为液体，则直接取1mL液体样品加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；

（2）PCR扩增条件：在0.2mL的PCR反应管中分别加入22uLPCR预混液，DNA聚合酶1uL、DNA模板2uL；

（3）将PCR管至于PCR仪中进行扩增；反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，29个循环，72℃再延伸5min；

（4）将PCR产物于质量比为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳；

（5）结果判定：扩增产物如果有354bp的条带，即表示有大肠杆菌O157:H7的存在；扩增产物如果没有354bp的条带，即表示无大肠杆菌O157:H7的存在。