[发明专利]试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法。 

背景技术

华发林（Warfarin，也称为“华法林”）是临床上最常用的香豆素类口服型强抗凝药物，广泛用于心脏瓣膜置换、房颤、肺栓塞、再次脑卒中（中风）等深度动静脉血栓性疾病的预防和治疗。该药物的化学结构为3-(a-苯基丙酮)-4-羟基香豆素，为两种光学同分异构体R型和S型的消旋体(racemic)混合物，其中S异构体的抗凝作用比R异构体更强3～5倍。华法林使用剂量在不同种族间及个体间存在较大差异，甚至可相差10到20倍。影响华法林剂量的因素主要有遗传因素以及身高、体重、年龄、性别、种族、药物相互作用等。华法林国际药理学联盟在新英格兰发表的研究显示，加入药物基因组学的预测模型（包括基因型）比临床预测模型（不包括基因型）准确性提高了80%。所以个体的遗传特征对于华法林的剂量影响很大。 

目前研究发现与华法林药效学和药动学相关的基因达30多种，起主要作用的有2种，VKORC1为其中之一。美国FDA在华法林用药说明书里介绍了VKORC1基因对剂量的影响并建议在用药之前做基因检测。VKORC1基因编码的蛋白质为组成维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位之一，主导维生素K依赖性凝血因子的生成，是华法林的作用靶点。VKORC1基因启动子区-1639G＞A多态性位点(rs9923231)与华法林临床用药剂量相关。与AA基因型启动子相比，GG和AG基因型启动子活性高，凝血因子生成较多，患者临床表现出华法林抵抗。在亚洲人群中研究结果显示，VKORC1的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了16-30%。因而，华法林用药之前，需药个体的VKORC1基因的rs9923231位点的基因型检测和分型，意义重大。 

然而，现阶段VKORC1基因的rs9923231位点的检测和基因型分型的方法仍有待改进。 

发明内容

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的： 

目前检测SNP位点的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是仍然是基于普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA 测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针杂交法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。Taqman探针杂交法的原理为：在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针，探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，探针的5’端标记有报告基因，如FAM、VIC，3’端标记有荧光淬灭基团，如MGB TAMRA；当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。由此，应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能够扩增出各自的基因型；用两种荧光信号能够被显著区分的荧光染料分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。因而，利用该方法进行SNP基因型分型时，引物和探针的设计至关重要，引物长度、探针长度、引物特异性和探针特异性均会显著影响检测结果的特异性和敏感性。 

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于VKORC1基因的rs9923231位点检测的试剂盒，以及确定待测DNA样本的VKORC1基因的rs9923231位点的基因型的方法。