[发明专利]一种定量测定水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1 NH4+吸收速率的方法

说明书

技术领域

       本发明涉及一种将水稻铵转运体基因OsAMT1;1构建到酵母表达载体pYES2上获得重组质粒OsAMT1;1-pYES2, 并将重组质粒转化进入酵母铵转运体缺失突变体菌株31019b中获得酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的重组工程菌OsAMT1;1-pYES2/31019b，OsAMT1;1-pYES2在31019中表达后使得铵转运体缺失体菌株31019b能够重新获得吸收铵的能力，以¹⁵NH₄Cl为底物，并利用¹⁵N同位素吸收测定技术可以定量的测定在外界不同铵浓度条件下水稻铵转运体OsAMT1;1对铵的吸收速率，从而定量地确定OsAMT1;1的吸铵功能，属于生物技术领域。

背景技术

      铵态氮可被直接同化为各种氨基酸并最终合成蛋白质, 是高等植物体内氮代谢的中心环节。自然条件下，植物体内的铵主要由根系从土壤中直接吸收获得，另有一部分来源于植物自身对硝酸盐和亚硝酸盐的还原以及内源氨基化合物的分解代谢。铵态氮的吸收和在植株体内器官、组织中的转运主要由铵转运蛋白家族各成员（Ammonium transporter，AMT）通过与其偶联的H⁺-ATPase所提供的细胞质膜内外化学渗透势梯度来介导完成（Ninnemann O, Jauniaux J C, Frommer W B. Identification of a high-affinity NH₄⁺ transporter from plants[J]. Embo Journal, 1994, 13(15): 3464-3471）。自从Ninnemann等（Ninnemann O, Jauniaux J C, Frommer W B. Identification of a high-affinity NH₄⁺ transporter from plants[J]. Embo Journal, 1994, 13(15): 3464-3471）首先在拟南芥上通过酵母功能互补克隆获得第一个植物来源的AMT基因以来，已有大量关于番茄（Dynowski M, Mayer M, Ludewig U. Ammonium ion transport by the AMT/Rh homologue LeAMT1;1 [J]. Biochemical Journal, 2006,396:431-437）、百脉根（D'Apuzzo E, Rogato A, Simon-Rosin U, El Alaoui H, Barbulova A, Betti M, Dimou M, Katinakis P, Marquez A, Marini A M, Udvardi M K, Chiurazzi M. Characterization of three functional high-affinity ammonium transporters in Lotus japonicus with differential transcriptional regulation spatial expression [J]. Plant Physiology, 2004,134(4): 1763-1774）、白菜(Pearson J N,Schjoerring J K, Finnemann J. Regulation of the high-affinity ammonium transporter (BnAMT1;2) in the leaves of Brassica napus by nitrogen status[J]. Plant Molecular Biology,2002, 49(5): 483-490) 、菜豆(Ortiz-Ramirez C, Mora S I, Trejo J, Pantoja O. PvAMT1;1, a highly selective ammonium transporter that functions as H⁺/NH₄⁺symporter [J]. Journal of Biological Chemistry, 2011,286(36): 31113-31122)和水稻(Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, von Wiren N, Yamaya T, Yamaguchi J. Distinct expression and function of three ammonium transporter genes (OsAMT1;1-1;3) in rice[J]. Plant and Cell Physiology, 2003, 44(7): 726-734) 等植物AMT基因的文献报道。鉴于铵转运体在铵吸收过程中的重要作用，定量测定其对外界铵的吸收速率，有利于进一步揭示植物体内铵转运机制，从而为利用基因工程培育铵高效利用型作物选定高效铵吸收基因提供理论依据。