[发明专利]基于内切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其实现方法，具体是一种能够外源表达内切葡聚糖酶(Sg-Ega)的大肠杆菌工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为l730亿t，所含总能量可达2×1018kJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。 

木质纤维素中的纤维素组分是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，性质稳定；纤维素降解需要纤维素酶的参与，纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统，主要由3类组成：内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4-glucanase)，又被称为Cx酶；外切葡聚糖酶(Exoglucanses)，又被称为C1酶；内切葡聚糖酶(β-glucosidase)，又被称为BG酶或CB酶。目前普遍接受的观点是3种酶协同作用于纤维素的降解过程，即首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将纤维二糖彻底水解为葡萄糖。因此，内切葡聚糖酶在纤维素的酶降解过程中起十分关键的作用。 

目前，各种纤维素酶基因均已在细菌中发现并被克隆。与真核生物纤维素酶基因相比，细菌纤维素酶基因具有不含内含子、易克隆、易表达及种类多等优势。其中，灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。作为一种放线菌，灰略红链霉菌之前的研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对较少。 

与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长、分化机制，对大分子多糖物质有很强的分解利用能力，如纤维素等。因此，研究链霉菌对大分子多糖物质的分解利用机制，发现全新的纤维素酶基因序列并通过克隆和转基因的方式对目的基因进行外源表达，对新型纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于内切葡聚糖酶的工程菌及其实现方 法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种基于内切葡聚糖酶的工程菌，能够外源表达内切葡聚糖酶的DH5α大肠杆菌。 

所述工程菌通过以下方式构建得到： 

1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1（CGMCC NO.5706）基因组DNA为模板进行PCR扩增； 

所述的PCR引物是指含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物，具体包括： 

正向引物Ega-NdeⅠ-F: 

5'-GGAATTCCATATGACCAACGGCTTCTACGTGGACCCCG-3' 

反向引物Ega-EcoRⅠ-R: 

5'-GGAATTCTCAGTAGCCGTAGATCATCTTGTAGGCGACCTC-3' 

所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。 

2）构建具有Sg-Ega基因的质粒：将步骤1得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到pET-30a质粒。 

所述的克隆载体采用pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。 

3）构建具有Sg-Ega基因的表达载体，具体步骤包括： 

3.1)用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切处理含有Sg-Ega基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有β-1,4-内切葡聚糖酶(Sg-Ega)基因的片段； 

3.2)用NdeⅠ和EcoRⅠ内切酶处理pET-30a质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段； 

3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg-Ega基因的表达载体。