[发明专利]CRY报告基因载体的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及CRY报告基因载体的构建方法及其应用。

背景技术

物质在细胞内的运输存在自由扩散与主动运输两种方式，后者显然对生物分子在特定位置发挥特定的作用具有决定性意义。在细胞向外分泌物质、细胞膜受体由高尔基体向细胞膜表面靶向运输及内质网与高尔基体之间进行物质交换的过程中，膜泡运输具有重要地位。Rab蛋白是一类包含数十种成员的GTP酶家族，其主要功能在于接力式地引导处于运输不同阶段中的膜泡，从而实现膜泡的定向运输。Rab8蛋白主要调控膜泡向靶膜的锚定与融合过程，在膜泡由高尔基体向中心体的定向运输中具有重要作用。Rab8蛋白的活性由其所结合的GTP/GDP状态决定，因此参与到调控GTP/GDP分子在Rab8结合位点进行交换的一系列蛋白均参与Rab8活性的调控。这些蛋白中，TBC1D1/4/30特异性水解GTP，而Rabin8和GDI2则分别催化GTP的装载及抑制GDP的解离。

现有研究表明，Rab8蛋白对于纤毛的正常组装具有重要调控作用：其不能水解GTP的突变体Rab8^Q67L促进纤毛组装，而其处于GDP结合状态的模拟突变体Rab8^T22N抑制纤毛组装。纤毛这一细胞器在个体发育过程中左右对称的形成、细胞对外界信号的感知以及细胞周期调控方面均具有重要作用。因此，对Rab8功能的研究，将有助于阐明纤毛组装与去组装的分子机制及膜泡介导的信号通路调控，从而为纤毛病的治疗提供理论依据。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供CRY报告基因载体的构建方法及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种CRY报告基因载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

（1）将Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD（101～300残基，Rab8Binding Domain，RBD）连入真核表达载体pECFP，构成CFP-RBD序列（CR）；

（2）将上述CFP-RBD序列进行克隆，再连入真核表达载体pEYFP，构成CFP-RBD-YFP序列（CRY），得到报告基因载体CRY；

所述Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD如SEQ ID No.1所示。

将上述报告基因载体转染目标细胞（组装或不组装纤毛的细胞均可），通过载体上的抗性基因，可以进行稳定表达系的筛选。

可选的，上述报告基因载体的构建方法可先构建RY再构建CRY，或构建YFP-RBD-CFP（YRC）。

进一步地，所述真核表达载体pECFP为pECFP-C1/2/3或pECFP-N1/2/3。

进一步地，所述真核表达载体pEYFP为pEYFP-C1/2/3或pEYFP-N1/2/3。

本发明还提供了按照上述构建方法构建得到的报告基因载体CRY。

进一步地，所述报告基因载体CRY的报告基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了前述报告基因载体在检测细胞内Rab8^GDP中的应用，其利用报告基因载体CRY的报告基因所编码的蛋白定位及识别Rab8^GDP，并对细胞内游离状态的Rab8^GDP进行半定量分析和定位分析，从而特异性追踪细胞内Rab8^GDP的变化。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种便利的、能够检测细胞内Rab8^GDP动态变化的方法。实验证明，本发明的CRY报告基因所编码的蛋白在定位及识别Rab8^GDP方面与内源Rabin8蛋白无异，且能够对细胞内游离状态的Rab8^GDP进行半定量分析和定位分析，从而可用于特异性追踪细胞内Rab8^GDP的变化及功能研究。

附图说明

图1为CRY报告基因的构建流程图。

图2为CRY报告基因的工作原理，及其所编码的蛋白与内源Rabin8蛋白功能和定位的比较。

图3为CRY报告基因所编码蛋白对Rab8^GDP含量的应达。

图4为CRY所示干涉某基因对细胞内游离状态Rab8^GDP含量的

影响。

具体实施方式