[发明专利]一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用。

背景技术

脂肽（lipopeptide）类生物表面活性剂是一种主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成的两性物质，由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸碳链组成。不同的芽孢杆菌菌株合成脂肽的种类也不同，根据脂肽的分子结构主要可分为表面活性素（surfactin）、芬芥素（fengycin、plipastatin）伊枯草菌素（iturin、bacillomycin、mycosubtilin）等。不同种类的脂肽的区别主要在于氨基酸组成与成环方式。例如，非极性的缬氨酸与亮氨酸，以及极性的谷氨酸与天冬氨酸组成的7肽构成了表面活性素的环状寡肽部分；而芬芥素A则含有酪氨酸、脯氨酸、鸟氨酸等氨基酸。脂肽，尤其是表面活性素具有良好的表面活性与生物相容性，在生物防治、环境保护以及石油开采领域有着广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌的脂肽合成水平低，与目前使用的化学表面活性剂相比成本劣势明显，因此脂肽的规模化生产和广泛应用还都没有实现。

目前，提高微生物脂肽生产水平的方法主要是通过优化培养条件与对菌株进行诱变。在培养条件方面，王德培等对发酵培养基成分、接种量、培养温度、通气量等因素进行了优化，枯草芽孢杆菌CGMCC Mo.3412抗菌脂肽的产量达到1～2g/L（CN101892176）。牟伯中等通过向培养基中添加特定种类的氨基酸，实现了枯草芽孢杆菌脂肽产量的提高（CN101775427）。Yoneda等分别以麦芽糖与黄豆粉为主要的碳氮源，培养20-90小时，使表面活性素的产量提高至50g/L（WO2002026961）。Fahim等分析了不同的发酵供氧条件对脂肽产量以及产物选择性的影响，其结果表明，k_La在0.04～0.08s^-1时表面活性素的产量最高（2g/L），而k_La在0.01s^-1时芬芥素的产量可达最高（0.3g/L）（Bioresource Technology,2012,126:1-6）。在菌种诱变方面，对玫瑰孢链霉菌ATCC31568进行紫外诱变，脂肽A21978C的产量提高了185%（CN101928677）。Carrera等使用亚硝基甲替尿烷（nitrosomethyl urethane，NMU）对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行化学诱变，得到的突变菌株经过40到90小时的发酵后，发酵液中表面活性素的浓度为2.0-4.0g/L（US5227294）。Liu等（Plasma Science and Technology,2006,8(4):491）使用低能氮离子束注入进行了菌株诱变，突变菌株发酵液50与100倍稀释后的表面活性分别是出发菌株的5.6倍与17.4倍。

除优化培养条件与菌株诱变外，利用基因工程手段对生产菌株进行遗传改造从而提高脂肽产量也有部分报道。顾晓波等在枯草芽孢杆菌细胞中表达comA基因，脂肽产量提高了50%（CN1554747）。卢兆新等在ATCC9943菌株中通过质粒超量表达脂肽抗性基因yerP，表面活性素与芬芥素产量分别是出发菌株的1.6与1.8倍（CN102220367）。通过将脂肽mycosubtilin合成酶的启动子进行替换，mycosubtilin的产量发生了8-10倍的提升（Bioresource Technology,2013,145:264-270）。

表面活性素在枯草芽孢杆菌细胞内合成，并被分泌到细胞外。脂肽跨膜运输载体蛋白则以主动运输的方式将细胞内合成并积累的表面活性素转移至细胞外。蛋白YcxA的基因ycxA在枯草芽孢杆菌基因组上位于表面活性素合成基因srfA下游，其表达产物根据二级结构预测分析为MFS家族跨膜蛋白，可能具有跨膜运输脂肽的功能（Molecular Microbiology,1993,8:821-831;Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2002,4:37-67）。未见有关于YcxA功能及其影响脂肽生产的研究结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌。

本发明的目的还在于提供上述高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌，其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株构建而成，其过表达脂肽载体蛋白YcxA。