[发明专利]基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统

说明书

技术领域

本发明涉及激光检测领域，尤其涉及一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统。

背景技术

常规光学显微镜的空间分辨率一直受限于衍射极限。光波由于其波动特性会发生衍射，因而光束不能无限聚焦，200nm是常规光学显微镜的理论分辨极限。而随着生命科学的迅速发展，研究已深入到单细胞、亚细胞和单分子这样的层次，光学显微镜的空间分辨率已经成为最为关键的核心问题。

近年来，基于现代测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新，远场光学显微镜得到了革命性的进展，分辨率提高到纳米尺度，其中主要包括：受激发射减损显微镜（Stimulated Emission Depletion（STED）Microscopy），饱和结构光学显微镜（Saturated Structured Illumination Microscopy，SSIM），基于探针定位技术的光敏定位显微镜（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）和随机光学重建显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

这些技术使得光学显微镜得以突破光波衍射极限的限制，直接在单分子水平上对生物细胞内部进行细微的观察研究。超高分辨光学显微方法的发展遇到的一个瓶颈问题就是很难实现生物活体组织的成像。究其本质，是因为这些显微方法都是基于单光子激发荧光技术，具有较差的光学穿透性，无法满足实际应用中的多种需要。

发明内容

本发明提供了一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，本发明突破了传统非线性光学显微的衍射极限限制，减少了荧光蛋白或者染料分子的光漂白效应，详见下文描述：

一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，所述超高分辨非线性激发荧光显微系统包括：飞秒激光器、连续激光器、分束片、光电二极管、第一双色分光镜、布拉格衍射晶体、第二双色分光镜、延迟装置、螺旋相位板或相位调制器、第三双色分光镜、第四双色分光镜、物镜、滤光片、雪崩式光电二极管或光电倍增管和样品台，

所述飞秒激光器生成飞秒激光；所述连续激光器产生连续的受激发射减损光；所述分束片反射第一束飞秒激光至所述光电二极管，所述光电二极管接收所述第一束飞秒激光，作为所述布拉格衍射晶体的触发源；

所述第一双色分光镜实现第二束飞秒激光和连续的受激发射减损光的合束；所述布拉格衍射晶体降低所述第二束飞秒激光的重复频率，同时，将所述连续的受激发射减损光调制成与所述第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，从而减少对样品的照度，降低光漂白效应；

所述第二双色分光镜将所述第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光分离；所述延迟装置用于调节所述调制后的受激发射减损光到达样品的时间；所述螺旋相位板或相位调制器调制所述调制后的受激发射减损光的空间相位；所述第三双色分光镜将所述调制后的受激发射减损光和所述第二束飞秒激光合束；所述第四双色分光镜用于分离荧光和杂散光；

所述物镜将所述第二束飞秒激光和所述调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；所述滤光片为带通滤光片，通过所述荧光；所述雪崩式光电二极管或光电倍增管探测所述荧光，获得单点荧光信号的光强；所述样品台对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

所述飞秒激光为超短脉冲激光，用于非线性激发荧光染料或荧光蛋白。

所述受激发射减损光为连续激光，用于荧光淬灭。

本发明提供的技术方案的有益效果是：该系统通过布拉格衍射晶体将飞秒激光的重复频率降到4MHz以下，显著提高了荧光分子的荧光量子产率。同时，布拉格衍射晶体将连续的受激发射减损光调制成与飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，不仅简化了装置，还减少了入射光的能量，降低了对样品的光漂白。

附图说明

图1：本系统的光路示意图；

图2：荧光分子跃迁和弛豫时间示意图；

图3：第二束飞秒激光、荧光和调制前后受激发射减损光的时间序列示意图。

其中(a)是第二束飞秒激光、荧光和调制前连续的受激发射减损光的时间序列示意图；(b)是第二束飞秒激光、荧光和调制后与第二束飞秒激光同步的受激发射减损光的时间序列示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1：飞秒激光器；                       2：连续激光器；