[发明专利]一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨肉瘤是骨骼系统常见的恶性肿瘤之一，好发于青少年。早期即可发生远处转移，预后差，表现为高度的基因组不稳定性、非整倍性、复杂的结构重组不平衡性和基因扩增。目前，临床上治疗骨肉瘤主要以手术和化疗为主。顺铂是常用的治疗骨肉瘤的一线用药之一。然而肿瘤细胞耐药性的产生限制了化疗药物的临床效果，给治疗带来了障碍。

顺铂属于DNA交联剂类抗肿瘤化疗药，使DNA链间共价交联，阻断DNA复制、转录和重组，从而杀伤肿瘤细胞。其耐药性的产生机制主要包括以下几个方面：减少药物在细胞内的积累（包括减少药物摄入和增加药物外排）；细胞内代谢降低药物毒性；增强对药物所致损伤的修复能力等。

人体细胞摄取顺铂等铂类化合物依赖于细胞上的铜离子转运体hCTR1。被摄入细胞的顺铂，部分进入细胞核与DNA形成铂-DNA加合物，发挥抗肿瘤作用。部分顺铂一方面与谷胱甘肽（glutathione，GSH）作用，形成Pt(GS)2复合物，通过ATP依赖的多药耐药蛋白MRP2（属于ABC-转运蛋白，由ABCC2基因编码），将此共价化合物排出细胞外；另一方面与细胞中的两种P型-ATP酶依赖的铜外排泵ATP7A和ATP7B上的铂结合位点结合，介导顺铂等铂类化合物在细胞内的转运和外排。所以在此过程中hCTR1、ATP7A和ATP7B的表达，MRP2、GSH或与其代谢有关酶活性增高均有可能参与顺铂耐药的产生。在对顺铂耐药的研究中发现，许多耐药细胞表现出hCTR1mRNA表达降低；多种肿瘤细胞中MRP2的过表达使其对顺铂的耐受增加；而反义干扰MRP2后，则可以逆转肿瘤细胞对顺铂的耐受性。此外，将表达ATP7A的载体转染到人卵巢癌细胞后，细胞获得了对顺铂、卡铂和奥沙利铂的耐受能力。人ATP7B，与ATP7A约含有65%的共同氨基酸序列，在多种顺铂耐药的肿瘤细胞（卵巢癌，胃癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等）中发现其过表达，是顺铂耐药性检测常用的分析指标之一。最新研究发现ATP7A和ATP7B蛋白受铜诱导人体转铜伴侣Atox1的调节，顺铂在胞浆可以与Atox1结合，这阻止了顺铂进入细胞核与DNA的作用，进而增加细胞对顺铂的耐受。

顺铂作为DNA损伤剂，癌细胞对其所致损伤的修复能力的提高也是其产生抗药性的重要原因之一。核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）是DNA链间交联修复的主要机制。DNA链间交联修复始动于交联位点两侧复制叉在交联位点的汇聚。复制叉无法通过交联位点，故在损伤位点两侧切割一条母链DNA，复制后产生双链断裂的DNA，最终通过同源重组或非同源末端连接方式完成修复。而另一条模板链跨越交联位点继续完成复制，最终保留交联损伤点。NER修复包括转录耦联核苷酸切除修复（transcription-coupled NER,TC-NER）和全基因组核苷酸切除修复（global genome NER,GG-NER）。研究发现，ERCC1、XPD是介导多种肿瘤细胞顺铂耐药的关键因子。ERCC2、ERCC5、XPA、XPC、XPF、CSB也与铂类药物的敏感性相关。另外有研究报道，MMR修复系统，也是涉及顺铂耐药性维持的一个重要因子。虽然MMR不修复顺铂所致的DNA交联，但该系统帮助检出顺铂-DNA加合物，并且MMR蛋白产生相关信号诱导细胞凋亡发生。因此，MMR的功能缺陷，使本该发生凋亡的复制损伤DNA存在，导致了顺铂耐药能力的增加。

多途径涉及顺铂耐药性的产生，不同的肿瘤细胞介导细胞耐药的形成机制也不尽相同。为了更好地分析骨肉瘤对顺铂的耐药机制，我们拟在体外建立骨肉瘤的顺铂耐药模型。

发明内容

本发明针对目前骨肉瘤治疗药物-顺铂耐药性的存在，给骨肉瘤的治疗带来的障碍，提供了一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法，本发明建立体外骨肉瘤细胞耐顺铂的模型，分析骨肉瘤细胞顺铂耐药后的形态学变化，染色体水平变化，生长性状改变，并对肿瘤细胞对顺铂药物耐受的分子机制进行初步分析，以期为骨肉瘤的临床治疗提供新的策略。