[发明专利]重组杆状病毒及其应用

说明书

本发明提供整合了编码γ‑谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及编码DT‑黄递酶（NQO1）的基因的重组杆状病毒。

技术领域

本发明涉及重组杆状病毒及含所述病毒的重组型维生素K依赖性蛋白质的制造用试剂盒。另外，本发明也涉及感染了重组杆状病毒的宿主细胞。再者，本发明也涉及重组型维生素K依赖性蛋白质的制造方法。

背景技术

维生素K是担负各种维生素K依赖性蛋白质的翻译后修饰的γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的辅因子。在维生素K的存在下，GGCX将各种维生素K依赖性蛋白质的指定的谷氨酸残基羧基化，转变为γ-羧基谷氨酸（Gla）。已知此γ-谷氨酰羧基化对于维生素K依赖性蛋白质的生物学功能（例如，血液凝固、骨代谢、信号传递等）极其重要。例如，作为维生素K依赖性蛋白质之一的血液凝固第II因子（凝血酶原）或第X因子通过γ-谷氨酰羧基化，能够向作为凝固反应的场所的细胞膜的磷脂结合，由此可接受由于其他因子开始的活化反应。

第II因子或如第X因子这样的维生素K依赖性凝血因子主要用人或牛的血浆作为原料进行制备，由此存在混入感染性物质或制品的批间有差异的问题。因此，近年研究－开发了通过利用哺乳动物细胞的基因重组技术制造维生素K依赖性凝血因子的方法。

但是，已知通过利用哺乳动物细胞的表达系统得到的维生素K依赖性凝血因子完全不被γ-谷氨酰羧基化。由于活化不被γ-谷氨酰羧基化的凝血因子通常是困难的，因此从产业上利用的观点来看，期望重组维生素K依赖性凝血因子在用表达蛋白质的系统得到的阶段就被充分地γ-谷氨酰羧基化。因此开发了，在利用哺乳动物细胞的表达系统中，通过共表达维生素K依赖性蛋白质和GGCX来得到γ-谷氨酰羧基化蛋白质的方法（参照WO2005/038019）。

另一方面，在维生素K依赖性蛋白质的γ-谷氨酰羧基化中，除了GGCX之外，已知维生素K环氧化物还原酶（VKOR）和DT-黄递酶（NAD（P）H依赖性醌氧化物还原酶1；也被称为NOQ1）也相关（参见Tie J-K.等人，Blood.vol.117，p.2967-2974（2011））。其中，与γ-谷氨酰羧基化直接相关的酶是GGCX，VKOR及NQO1是与维生素K的再循环相关的酶，近年也开发了在利用哺乳动物细胞的表达系统中，通过共表达维生素K依赖性蛋白质、GGCX及VKOR来得到γ-谷氨酰羧基化蛋白质的方法（参照WO2006/067116）。

发明概述

由于上述的方法均使用利用哺乳动物细胞的表达系统，γ-谷氨酰羧基化蛋白质的产量从工业规模的制造的观点来看极其少，另外还有制造成本高的问题。

另一方面已知用利用大肠杆菌的表达系统，可期待大量表达期望的蛋白质，但是所表达的蛋白质并未进行翻译后修饰。此外还知道，在使其表达结构复杂的蛋白质时，所述蛋白质几乎全部变成不溶性凝集体。另外，用以往的利用鳞翅目昆虫的表达系统可期待表达接近天然型蛋白质的翻译后修饰的蛋白质，但在本发明人的预备实验中，在蚕中表达的维生素K依赖性蛋白质几乎未被γ-谷氨酰羧基化。

鉴于上述这样的情况，本发明人以提供制造满足下述两个条件的重组型维生素K依赖性蛋白质的手段作为课题：可简便并且大量地制造维生素K依赖性蛋白质、和所得到的维生素K依赖性蛋白质被充分地γ-谷氨酰羧基化。

本发明人发现，使用整合有编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒、和整合有编码维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒的鳞翅目昆虫的表达系统，可简便并且大量地得到维生素K依赖性蛋白质，所得到的维生素K依赖性蛋白质被充分地γ-谷氨酰羧基化，从而完成本发明。

本发明提供整合了编码γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及编码DT-黄递酶（NQO1）的基因的重组杆状病毒。

本发明提供重组型维生素K依赖性蛋白质的制造方法。此方法包括下述步骤：使用整合有编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达γ-谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。