[发明专利]高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物工程下游蛋白质的纯化过程，尤其是涉及一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法。

背景技术

1995年哥伦比亚大学P.B.Fisher等用差示杂交的方法从人干扰素β和瑞香素(mezerein，MEZ)诱导的人类黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选得到一种新型细胞因子，命名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation-associated gene7，mda-7)，因其在结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子样特性等方面与IL-10家族相近，被归于IL-10家族，正式命名为白细胞介素-24(interleukin-24，IL-24)。MDA-7／IL-24可选择性抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统等，但对正常细胞没有影响。另外，IL-24还具有抑制肿瘤血管形成和免疫激活作用，在肿瘤细胞转移和系统性肿瘤免疫过程中发挥作用。鉴于MDA-7／IL-24的广谱抗肿瘤特性和独特的免疫调节作用，其已成为抗肿瘤生物药领域的研究热点。

Introgen公司与德克萨斯大学M.D.Anderson Cancer Center合作开发的基因治疗药物重组复制缺陷的腺病毒-IL-24(recombinant replication defective adenovirus-IL-24，Ad.IL-24)，商品名为INGN241，已经进入II期临床试验，其体内外实验和临床试验均证实了MDA-7／IL-24显著的抗肿瘤效果。但是腺病毒载体对一些低表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)的肿瘤细胞存在转染效率低的问题，限制了其应用范围。另外，腺病毒的基因治疗存在潜在的风险，其应用也受到社会和医学伦理的限制。Fuson等的研究表明MDA-7／IL-24的翻译后的糖基化仅影响其分泌和在胞外环境中的稳定性，对其抗肿瘤活性没有显著影响。因此，MDA-7／IL-24在原核生物工程菌中的重组表达研究也在进行中。但是IL-24在原核生物中的表达却不那么顺利，因为重组IL-24蛋白容易形成包涵体，并且形成的包涵体十分坚固，不利于后期的复性过程。目前，大肠杆菌生产IL-24的缺陷就在于形成的包涵体过于坚固，包涵体溶解效率低，故而复性收率低。另外低的溶解效率会导致后期的纯化收率低，纯化工艺繁琐。在包涵体的整个处理过程中包涵体的变性和复性是影响最大的两个因素，而包涵体的结构又会影响包涵体的变性过程。

发明内容

本发明的目的就是为了克服IL-24包涵体复性过程收率低、纯化困难的缺点而提供一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法。

本发明分析了IL-24包涵体的结构特点，本发明优化了包涵体的洗涤条件，洗涤方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度达96％的IL-24蛋白，且步骤得到了简化，节约了生产成本，操作简单。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌：

表达质粒为pET28a(+)，表达宿主为BL21(DE3)pLysS，白细胞介素-24的基因序列如Genbank号NM-006850所示；具体步骤如下：

1)编码人源IL-24基因的cDNA的序列如Genbank号NM-006850所示，根据基因序列进行引物设计，引物1含有Nde I酶切位点，引物2含有Hind III酶切位点，引物序列如下：

引物1：5′-GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT-3′，横画线表示Nde I酶切位点；

引物2：5′-CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3′，横画线表示Hind III酶切位点；

2)编码人源IL-24基因的cDNA在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，得到PCR产物；

3)PCR产物经Cycle-Pure Kit纯化后，用Nde I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶切的质粒载体pET-28a(+)，验证正确的阳性克隆即为含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌。

(2)重组大肠杆菌进行发酵培养：

重组大肠杆菌进行发酵培养时，接种量为2～4wt％。

所述的发酵培养包括诱导前培养与诱导后培养两个过程；