[发明专利]一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，为TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒；

(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤：

a.以序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，PCR反应，获得TAT-RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；

b.胶回收上述PCR产物，将目的基因和pGEX-4T-2表达质粒用BamH I和EcoR I进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆送样测序。

6.根据权利要求5所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：

将测序正确的含有pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌DH5α在在含100mg/l的LB培养基中37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导12h，异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。

8.根据权利要求4所述的一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：

a.利用GST标签纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白：

利用GST亲和层析，带有GST标签的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白选择性的吸附到谷胱甘肽纯化柱上，纯化获得GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

b.利用分子筛Sephadex G200进一步分离纯化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

c.收集上步纯化的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白，用thrombin酶切融合蛋白，去除GST标签，将酶切反应液浓缩后进行GST亲和层析去除GST标签，穿出液含有TAT-RhoGDI2融合蛋白，Thrombin酶通过超滤除去。

9.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的应用，其特征在于，所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24细胞转移。