[发明专利]一种检测犬猫弓形虫抗体的间接ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明公开了一种犬猫弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒，属于基因工程技术和诊断试剂领域。 

背景技术

弓形虫病是弓形虫引起的一种重要人兽共患寄生虫病，导致人及动物流产、畸胎、死胎，严重危害公共卫生安全和畜牧业生产。猫是弓形虫终末宿主，犬是弓形虫中间宿主，在弓形虫的传播与感染中起重要作用。目前弓形虫尚无有效疫苗，犬猫弓形虫感染的监测对于疾病的防控具有重要意义。 

弓形虫感染的诊断主要包括病原学、分子生物学及免疫学等方法。病原学方法费时、费力、敏感性低。分子生物学方法包括PCR、DNA探针及基因芯片等技术具有较高的敏感性和特异性，但需要昂贵的仪器设备，操作过程较复杂。免疫学检测方法包括染色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、间接血凝试验(IHA)、直接凝集试验(DAT)、改良凝集实验（MAT）、酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中DT需要用活的虫体，存在生物安全风险；IFAT具有较高的敏感性和特异性，但需要专门的仪器设备，不适合临床使用；IHA和LAT无种属特异性，但其敏感性较低；MAT检测结果被认为是金标准，但对犬弓形虫检测出率较低。ELISA敏感性、特异性较高，适合于大样本量检测。 

目前弓形虫ELISA检测所用的抗原多是虫体可溶性抗原，其成分不确定，抗原制备批次间差别较大，不易标准化。随着分子生物学技术不断发展，重组抗原作为弓形虫的诊断抗原具有无可比拟的优势，如抗原成分确定，易标准化，特异性强等。弓形虫速殖子有3种分泌细胞器，微线体、棒状体和致密颗粒。致密颗粒蛋白(dense granule protein, GRA)主要是在虫体修饰纳虫泡时及细胞内存活中起重要作用，与虫体在细胞内存活和复制有相关，能够引发宿主T细胞B细胞强烈的免疫应答，其中GRA7分泌过程持续速殖子感染宿主的整个阶段，是排泄分泌（ES）抗原的主要成分，能够刺激干扰素及肿瘤坏死因子的大量分泌，具有良好的免疫原性，是一种潜在的疫苗、诊断侯选抗原分子。本发明公开了以重组GRA7作为犬猫弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒，与其它方法相比，具有较强的敏感性和特异性。 

发明内容

本发明提供了一种以重组蛋白GRA7为抗原来检测犬猫弓形虫抗体的间接ELISA试剂盒，其目的在于克服现有技术存在的特异性不强、假阳性率高等缺点和不足，用于弓形虫抗体的定性检测。 

本发明提供的犬猫弓形虫抗体的间接ELISA试剂盒包括重组抗原GRA7预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。 

本发明所述的试剂盒制备方法包括以下步骤： 

1、弓形虫重组GRA7蛋白的表达与纯化：运用PCR技术扩增弓形虫GRA7基因，将其克隆入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组质粒pET-GRA7，经酶切鉴定分析和序列测定。将重组质粒pET-GRA7转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后，表达产物进行SDS-PAGE分析，在约29kDa处出现特异性表达带，与预期一致。重组菌裂解后，9000 rpm离心6 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白主要以不可溶性形式表达（图1）。Western blotting分析，表达产物能与弓形虫阳性血清反应（图2）。重组蛋白经Ni-NTA纯化后，纯度达90%以上（图3）。

2、抗原包被：将纯化的重组蛋白GRA7用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，包被96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜，用洗涤液洗5遍，每遍5min；加入5%脱脂奶粉配制成的封闭液，每孔100μL，温箱37℃，1h；随后用洗涤液洗涤5遍，每遍5min，4℃保存备用。 

3、兔抗犬或猫IgG的制备和辣根过氧化物（HRP）标记：按常规方法提取纯化犬或猫IgG，免疫家兔，当兔抗血清ELISA效价达1:32以上时取血清；硫酸铵沉淀纯化；用改良的过碘酸氧化法进行标记；最后酶标记物加入5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白和50%的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。