[发明专利]一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法

权利要求书

1.一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，包括：

（1）剪取松江鲈鱼的鳍条，提取基因组DNA；

（2）合成不同位点的微卫星正反向引物，引物序列如下：

SJL-C47：F:GGAGGCGGATGATGTTGGA；

R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC；

SJL-B61：F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG；

R:CCGACACGCTCACCGTATTTC；

SJL-D25：F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG；

R:GGCACATAACGGCTTCACTG；

（3）运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同松江鲈鱼个体进行3重PCR扩增；

（4）对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定个体的基因型，获得松江鲈鱼遗传多态性图谱。

2.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中的PCR扩增体系为10×Buffer5μL，25mM MgCl₂3μL，各含10mM dNTP1.0μL，100ng/μL模板1μL，SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47正反向引物各1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH₂O8.6μL。

3.根据权利要求2所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于：所述10×Buffer中含有200mM Tris-HCl pH8.825℃，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1.0%TritonX-100。

4.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中的PCR扩增程序为94℃变性5min后进行下面程序：94℃变性30S，55℃退火30S，65℃延伸1min，进行30个循环，最后65℃延伸7min。

5.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测具体为：首先用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色判断产物的有无，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶200V恒电压电泳1.5小时，7.5%的醋酸溶液固定15min，接着用去离子水洗胶3次，每次5min，然后0.15%的硝酸银溶液银染30min，显影2-3min，最后固定5min。