[发明专利]鸡新城疫病毒弱毒株、灭活疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株病毒弱毒株，尤其涉及一株鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus）弱毒株，本发明还涉及该鸡新城疫病毒弱毒株制备的灭活疫苗及其在制备预防、治疗或诊断新城疫药物或试剂中的应用，属于鸡新城疫病毒弱毒株的分离和应用领域。

背景技术

新城疫（Newcastle disease，ND）是禽类的一种急性、高度接触性传染病，其病原为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。ND给世界养禽业构成严重威胁并造成巨大损失，被国际兽疫局定为I类烈性传染病,因此新城疫是禽病研究的重点。尽管中国新城疫免疫接种已经普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生，严重威胁着养鸡业的健康发展。

根据新城疫病毒株致病性程度和发病后的病理变化的不同将其分为速发型毒株、中发型毒株和缓发型毒株。NDV只有一种血清型，但不同毒株的致病力、生物学特性及理化特性却不尽相同，即使毒力相同的毒株，在病毒红细胞凝集谱、病毒热稳定性等方面也存在明显差异。单克隆抗体等技术的应用从免疫学角度证实了不同毒株间的抗原决定簇存在差异，同时也证明免疫压力足以导致NDV的抗原变异。分子克隆技术的发展又进一步从分子水平证实了不同毒株的基因组间核苷酸一级结构及蛋白质二级结构上的差异，这些差异的存在给目前只使用少数几株疫苗来防制ND这种严重的禽类传染病的可行性提出了质疑。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)弱毒株；

本发明的目的之二是将所述的鸡新城疫病毒弱毒株应用于防治或诊断鸡新城疫。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus)弱毒株，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.7958；分类命名为：鸡新城疫病毒；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年7月16日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明主要通过以下方式分离得到所述的鸡新城疫病毒弱毒株：本发明人在黑龙江省大庆市郊某养殖场的濒死鸡中采集濒死鸡肝脏，研磨后用1500单位青、链霉素溶液于4℃处理12h，2000r/min离心，取上清接种鸡胚，收集48h-96h死亡鸡胚尿囊液。经过血凝和血凝抑制试验证明，本发明所分离的病毒株为鸡新城疫病毒株；本发明进一步将所收获的鸡胚尿囊液在鸡胚盲传5代；用PBS将长成单层的CEF清洗，接种万倍稀释的鸡胚毒，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃、5%CO₂环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒，进行15次连续传代培养，传至第20代最终分离获得一株鸡新城疫病毒弱毒DL11株。

静脉接种致病指数（IVPI）的测定试验表明，本发明所分离的鸡新城疫病毒DL11株的IVPI为0，说明该DL11株为弱毒株，通过进一步实验证明，DL11株半成品的红细胞凝集价、病毒含量均高于《兽用生物制品规程》的标准，生产成本较低，适合大生产的要求；用DL11株制备的灭活疫苗的免疫效力远远高于1︰16，且能抵抗强毒株攻击，完全能作为疫苗株进行使用。

本发明的另一个目的是用所分离的鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株）制备成鸡新城疫灭活疫苗，将其用于预防或治疗鸡新城疫。

由此，本发明提供了一种鸡新城疫灭活疫苗的制备方法，包括：

（1）培养所分离的鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株），得到病毒液；

（2）向病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；

（3）向灭活后的病毒液中加入佐剂制备得到水相；

（4）将水相加入到油相中，混合均匀，乳化，即得。

优选的，所述的水相按照以下方法制备得到：

按重量份计，取灭活抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，即得。

其中，所述的油相由白油、司本-80和硬脂酸铝组成；更优选的，所述的油相通过以下方法制备得到：按重量份计，将白油94份和司本-806份混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用，即得。

本发明所涉及到术语及定义