[发明专利]银环毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制备中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因及其疫苗的制备，特别是涉及一种从α、β和κ银环毒素中的多个抗原表位的人工合成多肽序列、基因及其应用，属于生物医学领域。 

技术背景

毒蛇咬伤在亚洲和非洲国家农村地区一直以来是一个非常严重的公共卫生问题。蛇毒毒素按其性质可分为神经毒、血循毒、混合毒三大类。针对毒蛇咬伤最有效的治疗药物主要是抗蛇毒血清，但由于蛇毒本身成分复杂，含有数十甚至上百种功能各异的蛋白质，用全毒免疫马生产的抗蛇毒血清中，不仅含有能中和毒素成分的抗体，同时也含有大量针对蛇毒中其它非毒素成分的抗体，这不仅使得抗血清效价降低，也增加了使用抗血清的不良反应率。蛇毒毒素按其性质可分为神经毒、血循毒、混合毒三大类。蛇毒神经毒素(neurotoxin,N T)是毒蛇毒液中毒性最大的成分,它能使动物产生迟缓性麻痹和呼吸衰竭,导致动物死亡。蛇毒的神经毒素主要存在于眼镜蛇科的眼镜蛇属，环蛇属和曼巴属毒蛇中。金环蛇、银环蛇、海蛇等主要含神经毒。尖吻蝮蛇、蝰蛇、烙铁头蛇、竹叶青等主要含血循毒。中国常见陆生毒蛇中毒性最强的就是含有神经毒的银环蛇，而银环蛇毒的主要致死性毒素是α和β银环毒素，因而通过生物信息学和分子生物学获得广谱的、只含有银环蛇毒中主要毒素成分关键抗原位点的新型抗原，对实现银环蛇伤高危人群的基因免疫或制备新型免疫原以获得高效、广谱的新型抗蛇毒抗体提供了一种新的抗原和基因，也为利用基因工程实现抗蛇毒抗体的人源化奠定了基础。目前抗蛇毒血清的制备主要是采用传统的蛇毒全毒免疫马获得，随着分子生物学、免疫学和基因工程技术的发展，发展了一些特异性和效价更高的抗蛇毒血清提的新技术和新方法。国际上主要有采用生化和毒素学手段首先分析鉴定出蛇毒中最主要的毒性成分，再利用这些成分的cDNA进行动物免疫。相关报道如下： 

1.Azofeifa-Cordero G,Arce-Estrada V,Flores-Díaz M,et al.Immunization with cDNA of a novel P-III type metalloproteinase from the rattlesnake Crotalus durissus durissus elicits antibodies which neutralize69%of the  hemorrhage induced by the whole venom[J].Toxicon2008,52:302-308. 

2.Harrison RA,Moura-Da-Silva AM,Laing GD,et al.Antibody from mice immunized with DNA encoding the carboxyldisintegrin and cysteine-rich domain(JD9)of the haemorrhagic metalloprotease,Jararhagin,inhibits the main lethal component of viper venom[J].Clin.Exp.Immunol.,2000,121:358–363. 

这些新的蛇毒抗血清的制备方法需首先从复杂的蛇毒中分离纯化出单一的毒素成分并进行鉴定后方能设计相应引物，再从毒腺中反转录出cDNA，而且由于针对的只是蛇毒中的单一一个毒素成分，因此对于含有多种致死性毒素成分的蛇毒往往不能达到良好疗效，同时对于不同蛇种的毒素由于存在种间差异，因此不能起到交叉中和作用。 

利用含有多个毒素抗原表位进行基因免疫或新型抗原制备获得抗毒素血清的研究报道有：英国利物浦大学的Wagstaff教授利用非洲锯鳞蝰（Echis ocellatus）cDNA文库的表达序列标签数据库，得到了7个SVMP抗原位点，串联后人工合成这7个抗原位点序列并免疫小鼠，免疫后的小鼠对多种非洲锯鳞蝰的SVMP都具有中和作用，并且能够中和数种其它非洲蝰科蛇毒；发明人小组利用金属蛋白酶基因数据库，得到了6个抗原位点，串联后合成的序列免疫小鼠，能够使免疫小鼠抵抗致死性尖吻蝮蛇毒的攻击。除此之外目前未见其它相关报道。相关文献见下： 

1.Wagstaff SC，Laing GD，Theakston RD，et al.Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom[J].PLoS Med，2006，3(6):e184.