[发明专利]一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药药材领域，具体涉及一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法。

 蛇床子为伞形科植物蛇床（Cnidium monnieri L. Cuss.）的干燥成熟果实，具有温肾壮阳、祛风、散寒、燥湿、杀虫、止痒功效，用于湿痹腰痛，带下，阴痒，阴道滴虫病，皮肤瘙痒，湿疹，宫冷不孕。蛇床子果实中主要含花椒毒素（xanthotoxin）、异虎耳草素(isopimpinellin)、欧前胡素(imperatorin)和蛇床子素(osthole)等具有生物活性的香豆素类化合物，结构式见附图1-4。现代药理学研究表明，蛇床子中香豆素类成分具有抗骨质疏松，抗心律失常，扩张血管、降低血压的作用，免疫抑制作用和抗肿瘤等方面均有作用。临床上蛇床子素软膏治疗婴儿湿疹，起效快、不良反应少。此外，蛇床子素还具有镇痛、局部麻醉和免疫调节等作用。有关蛇床子素含量测定的相关报道很多，《中国药典》2000版一部采用薄层色谱荧光扫描法测定蛇床子药材中蛇床子素的含量；孟凡浩，李遇伯，杨正毅等人，HPLC法同时测定蛇床子中蛇床子素和欧前胡素含量测定-沈阳药科大学学报，2004,21，（5）；罗维早，谭瑶，阳勇在专利申请号201010527673.4专利中研究一种从中药蛇床子中提取蛇床子素的方法；连其深发表的蛇床子的化学成分及药理作用研究进展-中药材，2003,26（2）；翁德新，李天傲等关于蛇床子中5种成分的HPLC测定法-中国中药杂志，2007,32（18）中对蛇床子中花椒毒素、异虎耳草素、香柑内酯、欧前胡素和蛇床子素这5种成分进行同时测定，但该文献中采用乙腈-0.1%的醋酸水溶液作为系统检测的流动相，进行梯度洗脱时，检测灵敏度低，分离效果差，存在一定的缺陷。而本发明中，采用HPLC法同时对蛇床子中的花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素这4种香豆素类成分进行测定，采用乙腈-磷酸盐缓冲液（pH=3.5）作为系统检测的流动相，进行梯度洗脱，检测灵敏度高，4种香豆素类成分分离效果好，分析方法简便快捷，易于操作，重现性好。

发明内容

    本发明的目的是提供一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法，所述测定方法采用HPLC法在双波长下对蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素4种香豆素类成分进行同时测定，方法操作简便快捷、分离效果好、灵敏度高。为达上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蛇床子提取物中主要成分含量测定的HPLC方法，其特征在于包括下述步骤：

1）本发明以60~75%的乙醇作为溶剂，优选75%的乙醇为提取溶剂，从中药材蛇床子中提取主要成分；

2）分别制备花椒毒素对照品（四川维克奇生物科技有限公司购买）溶液、异虎耳草素对照品（上海一基生物技术有限公司购买）溶液、欧前胡素对照品（中国药检所，批号110826-201214）溶液、蛇床子素对照品（中国药检所，批号110822-200407）溶液和制备蛇床子提取物供试品溶液；

3）利用HPLC法在双波长下同时检测蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量；

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相A，磷酸缓冲盐溶液（pH=3.5）为流动相B，梯度洗脱程序为：时间0→5min→20min→40min→55min；溶液A：95%→95%→65%→0%→95%；溶液B：5%→5%→35%→100%→5%；柱温25℃~40℃；体积流量0.8~1.5ml/min；检测波长为250nm和324nm，进样量1μl~15μl；理论塔板数按蛇床子素峰计算不得低于3000；

4）根据高效液相色谱分析结果计算蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量。

进一步地，本发明HPLC方法的色谱条件为：色谱柱为Agilent-C18 （ 250mm×4.6mm ，5μm），流动相为乙腈（A）—磷酸缓冲盐溶液（pH=3.5）（B），梯度洗脱程序为：时间0→5min→20min→40min→55min；溶液A：95%→95%→65%→0%→95%；溶液B：5%→5%→35%→100%→5%；柱温40℃；体积流量1.0ml/min；检测波长为250nm和324nm；进样量10μl。

进一步地，本发明HPLC分析方法中，花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品溶液制备方法包括：分别取花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇适量，分别配置成浓度为50、50、800和2000μg/ml的对照品溶液。