[发明专利]一种获得抗植物病原真菌活性物质的混菌发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种混菌发酵方法。

背景技术

土传病害具有危害重、难防治的特点，通常是利用高毒、剧毒的农药进行土传病的防治，但是随着人们安全环保意识的提高，高毒、剧毒农药在农业上的应用受到极大的限制。因此，急需高效、低毒的生物农药来解决土传病害的问题。

基因组学研究表明，某些细菌和真菌有很多控制次级代谢产物的基因在实验室条件下不表达或痕量表达，但是当进行共培养或混菌发酵时，它们的微生物邻居会诱导这些基因的表达或大量表达。而且人们往往更趋向于用两种或两种以上互相之间相容性好（指没有拮抗作用）或具有协同作用的菌株来进行共培养，或者利用指示菌来诱导共培养，以提高测试菌的抗菌活性（即测试菌对指示菌有明显的抑制作用，而指示菌对测试菌没有抗菌活性），如美国加州大学圣地亚哥分校海洋生物技术与医学中心的研究小组利用诱导共培养方式分离到了PEstalone、Libertellenones A-D、Emericellamides A-B等在纯培养条件下不曾得到的新化合物，如Trischman等将一株杆菌UA-094与另一株杆菌UA-086共培养，UA-094产吲哚和二酮哌嗪的能力显著提高。链霉菌FXJ2.014单培养时主要产生醌霉素A，而与枯草芽孢杆菌1.2428混合培养时产物中增加了醌霉素结构类似物FXJ2.014-HB，进一步增强了抗菌活性。但是，到目前为止，还未见利用两种互相有拮抗作用的微生物来进行共培养的研究，这在理论上曾经被人们认为是不可行的。

现有技术中，微生物源的农药品种少、防治效果不理想，且微生物源的农药品种基本上是纯菌种发酵的代谢产物或者活菌体制剂。在更多的情况下，本领域的技术人员将这些菌株分别进行纯培养后，再混合到一起来施用，甚至分别培养分别施用。纯培养后混合施用的缺点是工艺复杂，成本提高；分别培养分别施用的的缺点是单一菌株在田间的防效不稳定，受环境因子影响大。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中将两种具有拮抗作用的菌种在分别培养、分别发酵和分别施用的工艺繁琐及混合发酵液的抗菌活性低的问题，而提供一种获得抗植物病原真菌活性物质的混菌发酵方法。

一种获得抗植物病原真菌活性物质的混菌发酵方法，是按下述步骤实现：

一、制备两菌的斜面菌种：将侧孢短芽孢杆菌BL-21(Brevibacillus laterosporus BL-21)和枯草芽孢杆菌HNDF2(Bacillus subtilis HNDF2)分别接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，在温度为25℃～37℃的条件下恒温培养18h～24h后，即得到侧孢短芽孢杆菌BL-21的斜面菌种和枯草芽孢杆菌HNDF2的斜面菌种；

二、制备两菌的一级种子液：从步骤一制备得到的侧孢短芽孢杆菌BL-21的斜面菌种和枯草芽孢杆菌HNDF2的斜面菌种上分别取一环，再分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为20℃～37℃、振荡速率为50r/min～350r/min的条件下，震荡培养24h～96h，得到侧孢短芽孢杆菌BL-21的一级种子液和枯草芽孢杆菌HNDF2的一级种子液；

其中，所述的侧孢短芽孢杆菌BL-21的菌悬液与牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为（1～3）:100，所述的枯草芽孢杆菌HNDF2的菌悬液与牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为（1～3）:100；

三、制备两菌的二级种子液：将步骤二制备得到的侧孢短芽孢杆菌BL-21的一级种子液和枯草芽孢杆菌HNDF2的一级种子液分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为20℃～37℃、振荡速率为50r/min～350r/min的条件下，震荡培养24h～96h，得到侧孢短芽孢杆菌BL-21的二级种子液和枯草芽孢杆菌HNDF2的二级种子液；

其中，所述的侧孢短芽孢杆菌BL-21的一级种子液与牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为（1～3）:100，所述的枯草芽孢杆菌HNDF2的一级种子液接种与牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为（1～3）:100；

四、混菌发酵液的制备：将步骤三制备得到侧孢短芽孢杆菌BL-21的二级种子液和枯草芽孢杆菌HNDF2的二级种子液同时接种到发酵培养基中，在温度为20℃～37℃、振荡速率为50r/min～350r/min的条件下，震荡培养24h～96h，得到混菌发酵液；

其中，所述的侧孢短芽孢杆菌BL-21的二级种子液与发酵培养基的体积比为（1～3）:100，所述的侧孢短芽孢杆菌BL-21与枯草芽孢杆菌HNDF2的二级种子液的体积比为1:1；