[发明专利]一种铁皮石斛体细胞胚的增殖保存方法及培养基

说明书

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及一种铁皮石斛体细胞胚的增殖保存方法及培养基。 

背景技术

铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)，俗称铁皮枫斗，是兰科石斛属多年生草本植物，为名贵的传统中药,具重要的药用价值,有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺之功效，颇具市场开发价值。近年来,由于人们对其过度采挖,导致其野生资源急剧减少,日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物。由于铁皮石斛对生态环境要求高，自然条件下铁皮石斛繁殖率低生长速度缓慢，采用传统方法繁育铁皮石斛效率很低。因此铁皮石斛的组织培养研究得到了重视并获得了较大的进展。 

付传明等开展了铁皮石斛无菌播种产业化繁育技术研究，采用种子→原始球茎→完整植株→移栽的途径快速成苗进行工厂化生产，对各阶段培养基进行筛选，以及其他一些影响因子进行比较研究。结果表明：人工授粉后生长60～180天的铁皮石斛种子在离体条件下均能萌发，其中授粉150～180天种子的萌发效果最好，萌发率为87.2%～94.4%，适宜的萌发培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+马铃薯汁200g/L+AC1.0g/L；原始球茎增殖的最佳培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L；原始球茎在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+马铃薯汁200g/L+AC1.0g/L培养基上进行分化培养，分化的同时还能进行一定的增殖；将已分化的芽苗转接到壮苗培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L上培养1代后，转接到生根培养基1/2MS+NAA0.8mg/L+无机盐A0.2-0.5mg/L+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L上，培养50～70天后，生根率100%，无机盐A可以有效地控制愈伤或原始球茎的形成，明显提高生根苗的数量和质量。 

李丹等开展了黑节铁皮石斛原始球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根 的初步研究，认为，黑节铁皮石斛带芽茎段最佳的消毒方式为70%酒精处理30s后再用0.1%HgCl2处理20min。黑节铁皮石斛带芽茎段原始球茎诱导的最佳培养基为MS+KT1mg/L+NAA0.1mg/L。黑节铁皮石斛带芽茎段原始球茎再分化的最佳培养基为MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L。黑节铁皮石斛带芽茎段腋芽萌发的最佳培养基为MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L。这些实验结果为黑节铁皮石斛试管苗的工厂化生产奠定了技术基础。 

潘超美等取继代培养30天的铁皮石斛类原始球茎作接种材料，以N6为基本培养基，加入植物激素，并以真菌提取物作诱导子，对类原始球茎和愈伤组织进行诱导培养。显微观察结果表明铁皮石斛体细胞胚的形成可由愈伤组织的表皮细胞或内部细胞产生。认为铁皮石斛通过类原始球茎和愈伤组织的诱导培养能获得大量的丛芽。 

詹忠根等以铁皮石斛离体根尖为外植体，研究了在不同培养条件下离体根尖经愈伤组织形成体细胞胚及直接产生体细胞胚再生植株的细胞学过程，认为铁皮石斛类原始球茎是单细胞起源的真正体细胞胚。 

尽管铁皮石斛的组织培养获得了较大的成功，利用组织培养技术进行铁皮石斛种苗的快速繁育已没有很大的技术问题，但市场需要往往与生产情况不一致，如何使生产适合市场，是组培技术成功运用于生产、并取得较高经济效益的关键。为此，科学家开始研究组织培养材料的离体保存技术研究。陈勇等报道了铁皮石斛种质资源的玻璃化法超低温保存研究，对铁皮石斛的原生质体、原始球茎进行了玻璃化法超低温保存研究,存活率分别达48%和88%.实验结果表明：材料、预处理、化冻方法、冻前预培养基等因素都对存活率有较大影响。 

史永忠等报道了铁皮石解种质室温离体保存的研究，认为：铁皮石斛试管苗在1/2MS,附加NAA0.5mg/L、20g/L蔗糖、0.5mg/L活性炭和7g/L琼脂的培养基上，在普通培养室条件（25士2℃）下,连续保存12个月,存活率达100%。培养基中添加低浓度NAA、蔗糖和活性炭，可明显改变保存材料的状态。尽管史永忠等报道结果认为，经其保存的铁皮石斛试管苗恢复生长较快。但由于在保存试管苗期间，其基部开始生根，就不利于其增殖。虽然保存材料能较快地恢复生长，但若要进行保存材料的扩繁，需剪除根系，重新进行增殖的启动培养。因此该方法只适用铁皮石斛的保存，而不利于铁 皮石斛保存后恢复增殖。 

至今，未见铁皮石斛体细胞胚增殖保存方面的研究报道。 

发明内容