[发明专利]基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法

说明书

技术领域

本发明设计利用适配体技术对土霉素和卡那霉素进行检测，属于食品安全、检验检疫技术领域。

背景技术

近年来食品安全事件频发，严重影响了消费者的信心。其中，抗生素残留成为人们关注的焦点。在养殖过程中，四环素类抗生素和卡那霉素常被用作抗菌促生长添加剂和治疗用药。由于使用方法不当和不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，经过食物链被人体吸收后，可能产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡、造成肠道功能紊乱和增强细菌耐药性，给人类健康带来严重危害。

目前，抗生素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳技术(CE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析分析法(GICA)等。仪器分析方法具有灵敏度高、结果准确可靠等优点，但设备昂贵，前处理繁琐，检测时间长，不能满足大量样品筛选和现场快速检测的需要。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，其中以ELISA和GICA方法应用最多，但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。

核酸适配体（Aptamer）技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术(SELEX)，从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶分子高特异性结合的核苷酸片段。其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。具有高亲和力和特异性、制备简单、变性与复性可逆、性质稳定、易于标记等优点，日渐成为分析化学领域研究和应用的焦点。

目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中抗生素检测的报道，检测方法多以电化学生物传感器为主，虽然这些方法灵敏度高、选择性好，但是检测目标均是单一抗生素，无法满足抗生素多残留检测的需要。本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需要制备抗体的缺点，建立了基于磁珠分离-适配体识别的荧光检测方法，可用于食品中土霉素和卡那霉素多残留的快速、高灵敏度检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种同时检测食品中土霉素和卡那霉素残留的快速分析方法。其特点是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，分别与FAM和ROX标记的适配体互补链杂交，在不同的激发和发射波长下检测互补链上荧光标记物。当加入靶分子时，核酸适配体与靶分子特异性结合，导致与其互补杂交的荧光标记DNA短链的解离，引起荧光强度的变化来定量分析样品中土霉素和卡那霉素。

本发明所提供的食品中抗生素多残留适配体识别荧光检测方法，通过以下步骤实现。

1.氨基化纳米磁珠的制备：采用文献（Wu SJ, Duan NJ, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314）报道的方法进行制备，在30mL乙二醇中加入6.5g的1,6-己二胺，2.0g无水醋酸钠（CH₃COONa）和1.0g六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O），50℃搅拌，得胶体溶液，将溶液转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃反应6h。室温冷却，弃上层液体，去离子水冲出下层固体物质，磁分离收集。分别用去离子水和乙醇洗涤2次，50℃干燥5-10h。

2.亲和素偶联氨基化的纳米磁珠：定量称取纳米材料悬浮于PBS（10mM）中，超声分散15min，加入戊二醛溶液，使其终浓度为5%（v/v）。然后室温振荡2h，磁分离，弃上清，10mM PBS洗涤三次，除去多余的戊二醛。然后加入10mM的PBS，超声分散，加入一定量的亲和素，室温振荡12h，磁分离，弃上清，10mM PBS清洗三次。采用紫外分光光度计于280nm处测亲和素结合磁性纳米颗粒前后的吸光值。

3.生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠：将亲和素修饰的纳米材料悬浮于10mM PBS中超声分散，加入一定浓度的核酸适配体溶液，室温振荡4h，磁分离，弃上清，10mM PBS清洗三次以除去未结合的适配体，重悬于PBS缓冲液中。

4.适配体与互补链杂交：将一定浓度的FAM和ROX标记的互补链，加入上述悬浮液中，37℃避光孵育1h，磁分离，弃上清，PBS洗涤三次以除去游离的互补链，重悬于PBS缓冲液，利用荧光分光光度计，分别于495nm、588nm激发波长和520nm、608nm发射波长下，测其荧光值。