[发明专利]猪细小病毒病灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒病灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，属于猪细小病毒病灭活疫苗的生产领域。

背景技术

猪细小病毒(Porcine Parvovirus)是引起猪繁殖障碍重要原因之一。主要表现为初产母猪及血清抗体阴性经产母猪发生流产、死产和胎儿木乃伊化，而母猪通常并不表现临床症状。本病呈世界性分布，广泛的在各猪场中流行蔓延。我国自1983年报导本病以来，约有80%的猪场存在PPV感染，因而严重的影响了养猪事业的发展，为此研制一种安全有效的疫苗预防本病具有重要的实践意义。

目前在中国广泛应用的疫苗为猪细小病毒病灭活疫苗，疫苗的生产采用的是传统的转瓶工艺，该工艺在我国疫苗行业已经使用了数十年，其操作技术相对简单和成熟。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批次间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。本发明采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将ST细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪细小病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到猪细小病毒病灭活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度7°、摆动速度为12rpm。

采用WAVE波浪生物反应器培养ST细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度7°、摆动速度为12rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。

细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同ST细胞数的前提下，本发明考察Cytodex1含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时ST细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。从实验结果可以看出，随着微载体含量的增加，ST细胞密度会有所增加，但ST细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为3g/L时，ST细胞生长较快，培养时间为5天时，ST细胞密度达到了2.05×10⁷g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于3g/L时，ST细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养ST细胞时，所加入的微载体的含量优选为3g/L。因此综合考虑，本实验微载体含量优选采用3g/L。