[发明专利]HLA-B*27等位基因检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光定量技术，检测人类白细胞HLA-B*27抗原基因的检测方法及其配套使用的试剂盒。 

背景技术

HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。HLA有Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类基因，HLA-B*是Ⅰ类HLA基因的三个位点（HLA-A*、HLA-B*、HLA-C*）之一。而HLA-B27基因即人类HLA-I类分子B位点上的等位基因，位于第6号染色体短臂上，由8个外显子和7个内含子组织，编码分子质量为43KD的糖蛋白。该基因主要表达在机体所有的有核细胞表面，尤其是淋巴细胞表面有丰富的含量。 

强直性脊椎炎（Ankylosing Spondylitis AS）是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。该病以脊柱为主要病变部位的慢性病，累及骶髂关节，引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病变，属自身免疫性疾病。据资料统计，我国约有400余万强直性脊柱炎病人。它最为显著的变化为关节的纤维化和骨性强直。若不及时诊治，很容易导致患者关节畸形，终身痛苦，故有“不死的癌症”之称。上个世纪70年代Brewerlon等首先发现HLA-B*27抗原与强直性脊椎炎密切相关。此后，国内外对HLA与疾病的相关性研究层层递进，不断深入。研究结果不断证实了HLA-B*27抗原与强直性脊椎炎的强关联性：90％-95％的强直性脊椎炎患者表达了HLA-B*27基因，而普通人群中HLA-B*27的表达频率仅为5％-10％。在强直性脊椎炎患者中已检测到 B*2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2710、2715相关亚型的表达，其中白种人强直性脊椎炎患者与B*2707、B*2705亚型相关，亚洲人强直性脊椎炎患者与B*2704、B*2705亚型相关，而与中国强直性脊椎炎患者相关的亚型主要是B*2702、B*2704和B*2705。强直性脊柱炎的诊断主要依据患者骨侵蚀、硬化等形态学变化，从治疗角度讲，此时已发病4-10年，失去最佳的治疗时机，因此早期诊断成为争取良好预后的关键。临床上，对疑似病例或早期患者开展HLA-B27的检测，可起到辅助诊断的效果，对于疑难病例的诊断、鉴别诊断及预后判断，对患者亲属或子女患病风险的预测，尤其对于症状不明显的早期患者的确诊，均具有非常重要的参考价值。此外，还有许多疾病与HLA-B*27抗原的表达有着或多或少的关联性，如Reiter S综合症的HLA-B*27阳性率为70-90％，银屑病性关节炎的HLA-B*27阳性率为50-60％，葡萄膜炎的HLA-B*27阳性率为40-50％等等。因此，HLA-B*27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。 

近年来，随着人们对HLA-B*27与疾病相关性研究的逐渐深入，HLA-B*27的检测在临床上日益受到重视。HLA-B*27的检测技术也不断发展，目前常见的HLA-B27检测方法有流式细胞术（FCM）、微量淋巴细胞毒法（MLCT）、ELISA法、PCR-SSP法、实时荧光定量PCR等。在这些技术中，流式细胞术（FCM）、微量淋巴细胞毒法（MLCT）、ELISA法、PCR-SSP等方法或者硬件要求高，标本存放不易、或者操作复杂，检测容量小、或者准确性不高、，已很难适应临床检验的要求。而实时荧光定量PCR技术是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有着操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点。将FQ-PCR应用于HLA等位基因的检测是PCR技术领域的一项创新。 

Taqman PCR技术是FQ-PCR技术中更具技术优势的一种，本发明即将TaqmanPCR技术应用于HLA-B*27等位基因的检测，使Taqman PCR的技术优点（灵敏度 高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量）在HLA-B*27等位基因检测中得到完美继承。特别是本试剂盒利用设计了严谨的内对照体系，利用相对定量的原理对HLA-B*27等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*27等位基因的检测，可区分HLA-B*27等位基因的杂合型与纯合型，其结果可量化，对于HLA-B*27等位基因强关联性疾病的早期预警更具优势。