[发明专利]羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种羰基还原酶ChKRED20在不对称催化羰基底物合成手性醇中的用途。

背景技术

羰基还原酶是一类广泛应用于手性醇合成的重要酶类，利用羰基还原酶作为催化剂还原前手性的羰基化合物，可以直接构建光学活性醇的手性中心，从而一步法获得化学反应可能需要多步反应才能得到的手性化合物砌块。当前越来越多的羰基还原酶已用于工业生产手性醇（Nature,2012，485:185-194）。尽管如此，许多羰基还原酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最合适生物催化剂，因此在催化一些结构相似度很高的底物时才能获得较高的对映体过量值和活性。虽然通过蛋白质工程技术可以扩展羰基还原酶的底物谱，但扩展范围有限，这就使酶的应用范围相对较窄。

目前报道的羰基还原酶仅有少数催化前手性酮符合anti-Prelog规则（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry,2011，75：2155-2161），其中只有少量的文献研究这些羰基还原酶的底物谱（Tetrahedron:Asymmetry，2005，16：2539-2549）。从自然界中筛选的符合anti-Prelog规则的高效羰基还原酶，研究其可以高效高选择性催化的天然底物，可以拓展应用范围，丰富生物催化工具箱，提升该酶在多种化合物合成中的应用潜力，为这些化合物生物合成提供更多高效催化剂的选择。

氟取代的光学醇广泛应用在制药、放射指示剂等材料中，近来年研究者们积极探索以生物催化技术生产这类化合物（The Journal of Organic Chemistry,2013，78：7312-7317）。研究手性氟取代芳基醇生物催化工艺具有重要意义，可为这些化合物的生产提供新的环保路线。

发明内容

本发明的目的是提供羰基还原酶ChKRED20在催化多种羰基底物中的用途。该酶来源于金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49），具有高活力高对映选择性，该酶核苷酸序列和氨基酸序列及其在催化3,5-双三氟甲基苯乙酮中的应用已申请中国专利：一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产，申请号201310399109.2，申请日2013年9月5日。该酶在NCBI数据库中的登录号为KC342020。

金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）可以在中国典型培养物保藏中心获得，其保藏号为CCTCC M2012484；分类命名为金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）。在已公开的专利申请201310399109.2中已经保藏。

羰基还原酶ChKRED20的基因是通过PCR技术从金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）基因组中克隆获得。通过构建大肠杆菌异源表达体系使该酶过量表达。重组菌构建方法，诱导表达条件和纯化方法已经在申请人在前提交的专利申请（申请号201310399109.2，申请日2013年9月5日）的说明书以及实施例中有详细描述。即步骤为：将羰基还原酶ChKRED20的基因以常规PCR方法克隆，并连入pET28a（+）载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）中构建重组菌。挑取单克隆至LB（含卡那霉素50μg/ml）培养基中，37℃过夜培养，以1%的接种量转接至TB（含卡那霉素50μg/ml）培养基中，37℃培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，30℃继续培养至20～36h。

羰基还原酶ChKRED20的纯化采用镍柱亲和层析（Bio-Rad）。将上述诱导培养后的菌体以13,000rpm，4℃离心收集，重悬于Buffer A（50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑），超声破碎（超声10s，间隔30s，30次），之后以13,000rpm，4℃离心20min，将上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，轻微混匀30min，用含有20mM咪唑的Buffer A漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用BCA Protein Assay kit测定蛋白浓度。

本发明提供了羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在不对称催化多种前手性羰基底物生成相应手性醇中的应用，具体地说，这些底物包括如下化学式1、2或3所示的前手性羰基化合物。