[发明专利]一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），属于微生物技术领域。

背景技术

酿酒酵母广泛应用于食品、酿造及生物能源生产等不同领域，良好的细胞活性有利于增加生物量的积累，促进细胞循环使用，提高发酵效率，但酿酒酵母在生长和发酵过程中，尤其是在工业生产条件下，经常受到高浓度乙醇、极端温度（冷冻或高温等），低pH及高渗透压等环境胁迫因素的影响，这些环境胁迫条件抑制细胞生长及代谢，从而影响了生产效率（Journal of Biotechnology，2009，144：23-30）。因此，酿酒酵母细胞对环境胁迫因素的反应和耐受性机制一直是国内外学者研究的重点。

随着经济的快速发展，我国能源短缺问题不断突出。第二代生物乙醇以纤维素原材料，包括农作物秸秆，林业废弃物等发酵生产乙醇。与第一代生物乙醇不同之处在于，纤维素乙醇避免了与人争粮，与粮征地的弊端。在纤维素乙醇生产中，原料预处理过程中产生的弱酸类﹑醛类和酚类等抑制物对细胞的生长和发酵具有抑制作用（Biotechnology for Biofuels，2009，2：1-11）。为减小抑制剂的影响所采取的一些脱毒策略往往造成糖的损失和生产成本的增加,这在实际生产与经济上是不可行的，因而具有高耐受性的菌株的选育成为必要。近年来,通过细胞全局基因表达分析和各种组学数据分析（Antonie van Leeuwenhoek，2013，103：1281-1295）,以及对单基因敲除的所有突变体的表型组研究（Microbial Cell Factories，2010，9：79），对酿酒酵母乙酸耐性的分子机制有了更多新的认识,揭示了很多新的与乙酸毒性的适应性反应和乙酸耐性提高相关的基因。本发明得到的重组酿酒酿酒酵母就是以此获得，且本菌株具有较强的乙酸耐受性。

纤维素预处理的现在多通过物理、化学和生物方法实现，但是通过化学、物理方法的预处理需要消耗太多的能源且处理的过程中产生大量的污染物。生物酶解的过程比较温和，这一过程需要多种酶的参与，通过内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶把纤维素酶解成酵母细胞能够利用的糖类。此过程比较复杂，更重要的是水解产生的糖类对生物酶的活性有明显的抑制作用，因而同步糖化发酵（SSF）是必然的一种趋势，此过程可以减少纤维素乙醇发酵中的能耗，并且降低菌体污染的可能性。然而在较低的温度下，纤维素酶的水解效率会非常低，综合考虑水解和发酵过程（Biotechnology Advances，2012，30：1207–1218），耐高温酵母是一种必然的需求。本发明得到的重组酿酒酵母菌株能在较高温度下良好生长，可用于高温发酵。

发明内容

本发明的目的在于构建一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株，能在分别含有高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇和高温等环境胁迫条件下良好生长，并能在较强的环境胁迫条件下，比如高浓度乙酸条件下具有较高的乙醇发酵效率。

本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC No.8724，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年01月15日。

所述菌株SET5基因来源于实验室模式酿酒酵母S288c，将PCR扩增得到的SET5基因连接到pHO组成型整合表达载体（Applied Energy,2012,110：33-40），线性化后转入工业酿酒酵母，实现整合表达。

所述具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5）根据已有的转录组分析结果，选择变化显著的靶点SET5基因，该基因序列的GenBank登录号为NC_001140.6。PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的HO整合载体（NCBI：#AF324728，美国Utah大学David J.Stillman惠赠；Nucleic acids research，2001,29：e59）的基础上连接PGK1强启动子和CYC1终止子构成pHO组成型表达载体。然后把PCR扩增获得的SET5基因连接在PGK1启动子和CYC1终止子之间，线性化后电转导入工业酿酒酵母4126中，进行过表达。导入的质粒会在酿酒酵母基因组的HO基因位点（Yeast,1997,13：1563-1573）整合表达。