[发明专利]使用人工微RNA下调基因表达

说明书

本申请是申请日为2008年12月17日的中国专利申请200880121660.8“使用人工微RNA下调基因表达”的分案申请。

本申请要求于2007年12月18日提交的第61/014,510号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容全文引入本文以供参考。

技术领域

本发明的领域一般涉及植物分子生物学。具体地讲，它涉及下调靶序列表达的构建体和方法。

背景技术

微RNA(miRNA)仅仅在几年前被首次鉴定出来，但是已清楚的是，它们在调节基因活性中起重要作用。这些20-22核苷酸非编码RNA能够经由碱基配对与特异性靶mRNA杂交，并且通过介导RNA裂解或翻译阻抑来下调这些转录物的表达。

最近的研究已经表明，miRNA在发育期间具有重要功能。在植物中，已经表明他们控制多个发育过程，包括开花时间、叶子形态学、器官极性、花形态学以及根发育(综述于Mallory和Vaucheret(2006)Nat Genet38：S31-36中)。由于miRNA的确定的调节作用，他们有可能还参与某些主要作物特征例如抗旱性和抗病性。

miRNA被RNA聚合酶II转录成聚腺苷酸化的和加帽的信使，称为pri-miRNA。将这些pri-miRNA加工成更小的转录物，称为pre-miRNA，这些前体具有形成稳定的发夹结构的能力(参见Bartel(2004)Cell116：281-297；Jones-Rhoades MW，Bartel DP，Bartel B.MicroRNAS and their regulatory roles in plants.Annu Rev Plant Bio1.2006；57：19-53。)虽然在后生动物中，pri-miRNA在细胞核中通过Drosha被加工成pre-miRNA，并且在细胞质中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟与动物中的途径不同，因为植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在发夹加工中的已知功能以外，与Dicer同源的RNase III酶DICER-LIKE1(DCL1)还可具有Drosha功能(Kurihara和Watanabe(2004)Proc Natl Acad Sci101：12753-12758)。

最近已经在拟南芥靶向病毒mRNA序列(Niu等人(2006)Nature Biotechnology24：1420-1428)或内源基因(Schwab等人(2006)Plant Cell18：1121-1133)中描述了人工微RNA(amiRNA)。为了改变沉默的空间模式，可在不同启动子下表达amiRNA构建体(Schwab等人(2006)Plant Cell18：1121-1133)。人工miRNA置换微RNA及其在前体miRNA中的互补星状序列并替代靶向将被沉默的mRNA的序列。内源miRNA导致的沉默可见于多种空间上的、时间上的、和发育表达上的模式中(Parizotto等人(2007)Genes Dev18：2237-2242；Alvarez等人(2006)Plant Cell18：1134-51)。可构建人工miRNA以收集和扩展沉默模式的多样性和特异性。迄今仍无在作物植物中使用amiRNA的报道。

公布于2004年1月29日的WO2004/009779描述了用于在植物中调节基因表达的组合物和方法。

申请人的受让人的美国专利申请公布2005/0138689公布于2005年6月23日，描述了miRNa以及它们沉默靶序列的作用。

序列表简述

根据以下的详细描述以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和序列表形成本申请的一部分。

序列描述概要说明了后附的序列列表。此序列列表中以单个字母表示核苷酸，以单独的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal219(2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB标准中所规定的。

SEQ ID NO：1-10对应于用于扩增玉米基因组微RNA(miRNA)前体的引物。

SEQ ID NO：11-15分别对应于159c、164h、168a、169r、和396h的玉米miRNA前体序列。